適用于Cas9-RNP和其他核蛋白負荷的轉導的最小長度的穿梭劑肽及其變體制造技術

本文描述了用于將核蛋白負荷如Cas9

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】適用于Cas9
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RNP和其他核蛋白負荷的轉導的最小長度的穿梭劑肽及其變體
[0001]本說明書涉及經由基于肽的遞送系統在細胞內遞送核蛋白負荷。更具體地，本說明書涉及使用用于細胞內遞送核蛋白負荷如Cas9
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RNP的合成肽穿梭劑，以及經工程化以增加對核蛋白和/或細胞外DNA/RNA抑制的抗性的合成肽穿梭劑。
[0002]本說明書引用了許多文獻，將其內容通過引用以其整體并入本文。

技術介紹

[0003]使用CRISPR
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Cas酶進行基因組編輯具有巨大的治療潛力，但脫靶基因組編輯表現出安全性問題。核糖核蛋白(RNP)基因組編輯復合物的直接細胞內遞送比使用DNA遞送更可取，因為基因組編輯的迅速和隨后RNP的快速清除。常規方法依賴于脂質轉染或電穿孔以進行RNP遞送，這在治療用途上有其局限性。RNP與細胞穿透肽的綴合也已被探索并取得了有限的成功。因此，非常需要改進的RNP細胞內遞送技術。

技術實現思路

[0004]合成肽穿梭劑表示一種最近定義的肽家族，其先前被報道為快速且有效地將蛋白質負荷轉導至各種靶真核細胞的胞質溶膠和/或細胞核。與傳統的基于細胞穿透肽的細胞內遞送策略形成對照，合成肽穿梭劑優選地在跨質膜遞送時不與其多肽負荷共價連接。實際上，以不可切割的方式將穿梭劑共價連接至其負荷通常對其轉導活性產生負面影響。WO/2016/161516中描述了第一代此類肽穿梭劑，其中所述肽穿梭劑包含與細胞穿透結構域(CPD)可操作地連接的內體滲漏結構域(ELD)。WO/2018/068135隨后描述了基于一組十五個設計參數合理設計的其他合成肽穿梭劑，其唯一目的是改進蛋白質負荷的快速轉導，同時降低第一代肽穿梭劑的毒性。
[0005]大多數第一代和第二代穿梭劑是長度為至少二十個氨基酸的肽。本文進行了穿梭劑截短實驗以鑒定具有足夠負荷轉導活性的第一代和第二代合成肽穿梭劑的最小片段。這些實驗揭示，C末端截短通常比N末端截短更耐受，其中當在生理條件下(例如，在中性pH下)的溶液中，當預測N末端片段采用對應于兩親性陽離子α螺旋結構的“核心”區域時，C末端截短通常保留基本的負荷轉導活性。本文描述了該核心區域和/或低于20個氨基酸的穿梭劑的常見生理化學特性。
[0006]在一個方面，本文描述了長度小于20個氨基酸的具有負荷轉導活性的合成肽穿梭劑及其用于在真核細胞中遞送多種負荷的用途。所述穿梭劑通常包含含有兩親性螺旋的螺旋區域，所述兩親性螺旋具有：在所述螺旋的一側的疏水氨基酸殘基簇，其在Schiffer
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Edmundson輪表示中限定140
°
至280
°
疏水角；在所述螺旋的另一側的帶正電的殘基簇，其在Schiffer
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Edmundson輪表示中限定40
°
至160
°
帶正電的角。
[0007]雖然第一代和第二代穿梭劑有效地將Cpf1
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RNP(Cas12a
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RNP)基因組編輯復合物遞送至真核細胞的細胞核，但本文顯示它們在遞送Cas9
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RNP方面效率較低。雖然共享相似的大小(SpCas9為170kDa以及AsCpf1為156kDa)，但在這兩種酶之間的可能影響遞送的主要
差異是由它們各自的指導RNA貢獻的凈負電荷密度。AsCpf1使用簡單的crRNA(CRISPR RNA)(約42個核苷酸)，并且SpCas9需要crRNA和tracrRNA(反式激活crRNA)(約100個核苷酸)。本文描述了適于改進Cas
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RNP遞送的合成肽穿梭劑，所述合成肽穿梭劑包括較短的肽以及在一個或兩個側翼區段中具有降低的陽離子電荷密度的肽。
[0008]在其他方面，本文描述了一種組合物，所述組合物包含用于細胞內遞送的核蛋白負荷和獨立于所述核蛋白負荷或不與所述核蛋白負荷共價連接的合成肽穿梭劑，所述合成肽穿梭劑是包含具有帶正電的親水外表面和疏水外表面二者的兩親性α
?
螺旋基序的肽，其中與不存在所述合成肽穿梭劑相比，合成肽穿梭劑增加所述核蛋白負荷在真核細胞中的胞質溶膠/細胞核遞送。在實施方案中，所述核蛋白負荷是脫氧核糖核蛋白(DNP)或核糖核蛋白(RNP)復合物，如Cas9
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RNP。
[0009]在一些實施方案中，本文所述的穿梭劑可以包含如本文所定義的母體穿梭劑的片段，其中所述片段保留負荷轉導活性并且包含具有帶正電的親水外表面和疏水外表面二者的兩親性α
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螺旋基序。在一些實施方案中，本文所述的穿梭劑可以包括如本文所定義的母體穿梭劑的變體，其中所述變體保留負荷轉導活性，并且與所述穿梭劑的不同之處在于(或僅在于)具有相對于所述母體穿梭劑降低的C末端正電荷密度(例如，通過用非陽離子殘基、優選非陽離子親水殘基取代一個或多個陽離子殘基，如K/R)。在一些實施方案中，本文所述的穿梭劑片段和/或變體對核蛋白和/或細胞外DNA/RNA抑制具有增加的抗性，和/或對核蛋白負荷具有增加的轉導活性。
[0010]通用定義
[0011]提供標題和其他標識符(例如，(a)、(b)、(i)、(ii)等)只是為了便于閱讀說明書和權利要求書。說明書或權利要求中的標題或其他標識符的使用不一定要求該步驟或要素按字母或數字順序或它們提供的順序進行。
[0012]在權利要求書和/或說明書中，當與術語“包含(comprising)”連用時，詞語“一個/一種(a或an)”的使用可以指“一個/一種(one)”，但也與“一個/一種或多個/多種(one or more)”、“至少一個/一種(at least one)”和“一個/一種或超過一個/一種(one or more than one)”的意思一致。
[0013]術語“約”當在本文中使用時指示某數值包括為了確定所述值而采用的裝置或方法的誤差的標準偏差。一般來說，術語“約”意指至多10％的可能變動。因此，某一數值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的變動被包括在術語“約”之內。除非另外指明，否則當在某一范圍之前使用術語“約”適用于該范圍的兩端。
[0014]如本說明書和權利要求書中所用，詞語“包含(comprising)”(和包含的任何形式，諸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，諸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，諸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，諸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或是開放性的，且不排除另外、未列舉的要素或方法步驟。
[0015]如本文所用，“蛋白質”或“多肽”或“肽”意指任何肽連接的氨基酸鏈，其可以包含或可以不包含任何類型的修飾本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種組合物，所述組合物包含用于細胞內遞送的核蛋白負荷和獨立于所述核蛋白負荷或不與所述核蛋白負荷共價連接的合成肽穿梭劑，所述合成肽穿梭劑是包含具有帶正電的親水外表面和疏水外表面二者的兩親性α
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螺旋基序的肽，其中與不存在所述合成肽穿梭劑相比，合成肽穿梭劑增加所述核蛋白負荷在真核細胞中的胞質溶膠/細胞核遞送。2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述核蛋白負荷是脫氧核糖核蛋白(DNP)或核糖核蛋白(RNP)負荷。3.根據權利要求1或2所述的組合物，其中所述核蛋白負荷是RNA指導的核酸酶；Cas核酸酶，如Cas I、II、III、IV、V或VI型核酸酶，或其缺乏核酸酶活性的變體；堿基編輯器；或先導編輯器；CRISPR相關轉座酶；或Cas重組酶(例如，recCas9)。4.根據權利要求1至3中任一項所述的組合物，所述核蛋白負荷是Cpf1
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RNP。5.根據權利要求1至3中任一項所述的組合物，所述核蛋白負荷是Cas9
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RNP。6.根據權利要求1至5中任一項所述的組合物，其中所述核蛋白負荷不與細胞穿透肽共價連接或預復合。7.根據權利要求1至6中任一項所述的組合物，其中所述穿梭劑是：(1)長度為至少12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸的肽，所述肽包含(2)兩親性α
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螺旋基序，所述兩親性α
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螺旋基序具有(3)帶正電的親水外表面和疏水外表面，其中遵守以下參數(4)至(15)中的至少五個：(4)基于每圈具有3.6個殘基的α
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螺旋的開放圓柱形表示，所述疏水外表面包含由空間上相鄰的L、I、F、V、W和/或M氨基酸組成的高疏水核心，所述氨基酸占所述肽的氨基酸的12％至50％；(5)所述肽具有3.5至11的疏水矩(μ)；(6)所述肽在生理pH下具有至少+3或+4的預測凈電荷；(7)所述肽具有8至13的等電點(pI)；(8)所述肽由35％至65％的如下氨基酸的任何組合構成：A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V；(9)所述肽由0％至30％的如下氨基酸的任何組合構成：N、Q、S和T；(10)所述肽由35％至85％的如下氨基酸的任何組合構成：A、L、K或R；(11)所述肽由15％至45％的如下氨基酸的任何組合構成：A和L，前提是所述肽中存在至少5％的L；(12)所述肽由20％至45％的如下氨基酸的任何組合構成：K和R；(13)所述肽由0％至10％的如下氨基酸的任何組合構成：D和E；(14)所述肽中A和L殘基的百分比(A+L％)與所述肽中K和R殘基的百分比(K+R)之間的差小于或等于10％；以及(15)所述肽由10％至45％的如下氨基酸的任何組合構成：Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。8.根據權利要求7所述的組合物，其中：(a)所述穿梭劑遵守參數(4)至(15)中的至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個，或遵守其全部；(b)所述穿梭劑是具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29
或30個氨基酸的最小長度和40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140或150個氨基酸的最大長度的肽；(c)所述兩親性α
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螺旋基序具有在3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限與9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11.0的上限之間的疏水矩(μ)；(d)所述兩親性α
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螺旋基序包含帶正電的親水外表面，基于連續氨基酸之間的旋轉角為100度的α
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螺旋和/或每圈具有3.6個殘基的α
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螺旋，所述帶正電的親水外表面包含：(i)在螺旋輪投影時的至少兩個、三個或四個相鄰的帶正電的K和/或R殘基；和/或(ii)在螺旋輪投影時的包含三至五個K和/或R殘基的六個相鄰殘基的區段；(e)所述兩親性α
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螺旋基序包含疏水外表面，基于連續氨基酸之間的旋轉角為100度的α
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螺旋和/或每圈具有3.6個殘基的α
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螺旋，所述疏水外表面包含：(i)在螺旋輪投影時的至少兩個相鄰L殘基；和/或(ii)在螺旋輪投影時的包含選自L、I、F、V、W和M的至少五個疏水殘基的十個相鄰殘基的區段；(f)所述疏水外表面包含高疏水核心，所述高疏水核心由空間上相鄰的L、I、F、V、W和/或M氨基酸組成，所述氨基酸占所述穿梭劑的氨基酸的從12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％至25％、30％、35％、40％或45％；(g)所述穿梭劑具有在4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的下限與9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4或10.5的上限之間的疏水矩(μ)；(h)所述穿梭劑具有在+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9至+10、+11、+12、+13、+14或+15之間的預測凈電荷；(i)所述穿梭劑具有10至13的預測pI；或(j)(a)至(i)的任何組合。9.根據權利要求7或8所述的組合物，其中所述穿梭劑遵守以下參數中的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個或全部：(8)所述穿梭劑由36％至64％、37％至63％、38％至62％、39％至61％或40％至60％的如下氨基酸的任何組合構成：A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和V；(9)所述穿梭劑由1％至29％、2％至28％、3％至27％、4％至26％、5％至25％、6％至24％、7％至23％、8％至22％、9％至21％或10％至20％的如下氨基酸的任何組合構成：N、Q、S和T；(10)所述穿梭劑由36％至80％、37％至75％、38％至70％、39％至65％或40％至60％的如下氨基酸的任何組合構成：A、L、K或R；(11)所述穿梭劑由15％至40％、20％至40％、20％至35％或20％至30％的如下氨基酸的任何組合構成：A和L；(12)所述穿梭劑由20％至40％、20％至35％或20％至30％的如下氨基酸的任何組合構成：K和R；(13)所述穿梭劑由5％至10％的如下氨基酸的任何組合構成：D和E；
(14)所述穿梭劑中A和L殘基的百分比(A+L％)與所述穿梭劑中K和R殘基的百分比(K+R)之間的差小于或等于9％、8％、7％、6％或5％；以及(15)所述穿梭劑由15％至40％、20％至35％或20％至30％的如下氨基酸的任何組合構成：Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T和H。10.根據權利要求1至9中任一項所述的組合物，其中所述穿梭劑包含富含組氨酸的結構域，任選地其中所述富含組氨酸的結構域：(i)朝向所述穿梭劑的N末端和/或C末端定位；(ii)是包含至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％組氨酸殘基的至少3、至少4、至少5或至少6個氨基酸的延伸段；和/或包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9個連續組氨酸殘基；或(iii)(i)和(ii)二者。11.根據權利要求1至10中任一項所述的組合物，其中所述穿梭劑包含富含絲氨酸和/或甘氨酸殘基的柔性接頭結構域(例如，分隔開所述穿梭劑的N末端和C末端區段；或位于中心兩親性陽離子α螺旋結構域的N末端和/或C末端)。12.根據權利要求1至11中任一項所述的組合物，其中所述穿梭劑包含以下氨基酸序列或由其組成：(a)[X1]
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A
?
1[ζ]
?
A
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1[+]；并且[接頭]選自：
?
Gn
?
；
?
Sn
?
；
?
(GnSn)n
?
；
?
(GnSn)nGn
?
；
?
(GnSn)nSn
?
；
?
(GnSn)nGn(GnSn)n
?
；以及
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(GnSn)nSn(GnSn)n
?
；其中：[Φ]是氨基酸，其為：Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr或Val，優選Leu、Phe、Trp或Ile；[+]是氨基酸，其為：Lys或Arg；[ζ]是氨基酸，其為：Gln、Asn、Thr或Ser；A是氨基酸Ala；G是氨基酸Gly；S是氨基酸Ser；并且n是從1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至1至4或1至3的整數。13.根據權利要求1至12中任一項所述的組合物，其中所述穿梭劑包含以下項或由以下項組成：(i)SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、346、348、352、355、356、358至360、362、363、366、369、370或379中任一個的氨基酸序列；(ii)與SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311、313至324、326至332、338至342、344、346、348、352、355、356、358至360、362、363、366、369、370或379中任一個相差不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸(例如，排除任何接頭結構域)的氨基酸序列；(iii)與SEQ ID NO:1至50、58至78、80至107、109至139、141至146、149至161、163至169、171、174至234、236至240、242至260、262至285、287至294、296至300、302至308、310、311...

【專利技術屬性】
技術研發人員：D，
申請(專利權)人：費爾丹生物公司，
類型：發明
國別省市：