噁霜靈半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了噁霜靈半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法，以及將其應(yīng)用于酶聯(lián)免疫試劑盒，試劑盒包括：包被有包被原的酶標(biāo)板、噁霜靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液、噁霜靈抗體、酶結(jié)合物濃縮液、酶結(jié)合物稀釋液、底物顯色液、終止液、洗滌液，所述包被原為噁霜靈偶聯(lián)抗原，所述酶結(jié)合物為酶標(biāo)記的噁霜靈抗體，所述噁霜靈抗體是由免疫原免疫動物得到的。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測噁霜靈的方法，它包括：首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明專利技術(shù)提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測煙葉(采后待烤煙葉、初烤煙葉)樣本中噁霜靈的含量，其操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
噁霜靈半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)涉及一種噁霜靈半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)，具體涉及一種噁霜靈人工抗原分子結(jié)構(gòu)以及用于檢測噁霜靈的酶聯(lián)免疫試劑盒，可定性、定量檢測煙葉(采后待烤煙葉、初烤煙葉)中噁霜靈藥物的殘留量。

技術(shù)介紹

[0002]噁霜靈是一類內(nèi)吸性農(nóng)用殺菌劑，殺菌廣譜，對霜霉目病源菌具有很高的防效，有保護(hù)和治療作用，持效期長，主要用于防治蔬菜、瓜果等病害。由于農(nóng)藥在使用過程中普遍存在并會污染到環(huán)境中。GB 2763
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2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對蔬菜中的最大殘留限量為0.5mg/kg；中國煙草總公司發(fā)布的YQ50
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2014《煙葉農(nóng)藥最大殘留限量》對煙葉中噁霜靈的最大殘留限量為0.1mg/kg。
[0003]檢測噁霜靈的方法有氣相色譜法、氣相色譜法
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串聯(lián)質(zhì)譜法、超高效液相色譜
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質(zhì)譜/質(zhì)譜法、液相色譜
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質(zhì)譜/質(zhì)譜法等。與上述方法相比，免疫化學(xué)檢測法對藥物檢測具有快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確、可以批量監(jiān)測、樣品處理簡單、能實現(xiàn)自動化操作等優(yōu)點。而免疫化學(xué)法檢測噁霜靈的前提是需要具備針對噁霜靈的抗體，本申請專利技術(shù)了噁霜靈人工抗原制備方法，并將其應(yīng)用于酶聯(lián)免疫試劑盒中，用時短，操作簡單，成本較低，適用于基層單位大批量地檢測樣品。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0004]本專利技術(shù)的目的在于提供一種能夠檢測煙葉(采后待烤煙葉、初烤煙葉)中噁霜靈藥物殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。
[0005]本專利技術(shù)試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標(biāo)板、噁霜靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液、噁霜靈抗體、酶結(jié)合物濃縮液、酶結(jié)合物稀釋液、底物顯色液、終止液、洗滌液，所述包被原為噁霜靈偶聯(lián)抗原，所述酶結(jié)合物為酶標(biāo)記的噁霜靈抗體。
[0006]所述噁霜靈特異性抗體是以一種噁霜靈人工抗原作為免疫原制備獲得，所述噁霜靈特異性抗體可為噁霜靈單克隆抗體或噁霜靈多克隆抗體，其中優(yōu)選噁霜靈單克隆抗體。
[0007]所述酶結(jié)合物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶結(jié)合物是由酶和噁霜靈抗體偶聯(lián)得到的。
[0008]為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括噁霜靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液。
[0009]所述噁霜靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0mg/L，0.1mg/L，0.3mg/L，0.9mg/L，2.7mg/L，8.1mg/L。
[0010]當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為1～2mol/L的硫酸溶液或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸
鹽緩沖液，所述終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。
[0011]所述洗滌液優(yōu)選為pH值為7.4，含有0.5％～1.0％吐溫
?
20、0.01
‰
～0.03
‰
疊氮化鈉防腐劑、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0012]其中在酶標(biāo)板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，封閉液為pH值為7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0013]本專利技術(shù)中酶標(biāo)板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封閉液，25℃避光孵育1～2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。
[0014]本專利技術(shù)的檢測原理為：
[0015]本試劑盒采用ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的噁霜靈和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗噁霜靈的酶結(jié)合物，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物噁霜靈的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中噁霜靈的殘留量。
[0016]本專利技術(shù)還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測噁霜靈的方法，它包括步驟：
[0017](1)用試劑盒進(jìn)行檢測；
[0018](2)分析檢測結(jié)果。
[0019]本專利技術(shù)檢測噁霜靈的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用ELISA方法定性或定量檢測樣品中噁霜靈的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批量樣品；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點。本專利技術(shù)的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。
附圖說明
[0020]圖1：噁霜靈半抗原的分子結(jié)構(gòu)式
具體實施方式
[0021]下面結(jié)合具體的實施例來進(jìn)一步闡述本專利技術(shù)。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本專利技術(shù)，而不用來限制本專利技術(shù)的范圍。
[0022]實施例1試劑盒組分的制備
[0023]1、噁霜靈半抗原的制備
[0024]取2.98g化合物a，加甲苯100ml溶解，加2.24g叔丁醇鉀，加巰基丙酸1.27g，充分?jǐn)嚢韬蠹尤氪姿徙U0.3g，加配體(R)
?
(
?
)
?1?
[(S)
?2?
(二環(huán)己基膦)二茂鐵]乙基二叔丁基膦0.5g，攪拌，加熱110℃反應(yīng)4h，停止反應(yīng)，旋蒸除去甲苯，加水200ml，加1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值到6，加乙酸乙酯200ml萃取，有機(jī)相蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷/甲醇(v/v,10/1)洗脫分離，得到化合物b1.21g，即為半抗原產(chǎn)物，收率32.88％。
[0025]2、抗原的制備
[0026]免疫原制備——噁霜靈半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0027]取化合物b 12.26mg，加1mlDMF溶解澄清，加NHS6.77mg，EDC9.57mg，充分溶解混勻，室溫反應(yīng)2h，得到半抗原活化液A液；取匙孔血藍(lán)白蛋白(KLH)50mg，加0.1M CB9.5緩沖液4ml溶解，得到B液，將A液逐滴滴加到B液中，室溫反應(yīng)6h，停止反應(yīng)，0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，離心分裝，得到噁霜靈
?
KLH偶聯(lián)物，即為免疫原。
[0028]包被原制備——噁霜靈半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原。
[0029]取化合物b16.35mg，加1mlDMF溶解澄清，加NHS11.2mg，EDC13.57mg，充分溶解混勻，室溫反應(yīng)2h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白(OVA)100mg，加0.1M CB9.5緩沖本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種煙草中噁霜靈檢測用半抗原，其特征在于，分子式：C
16
H
20
N2O6S，結(jié)構(gòu)式如下：2.一種含如權(quán)利要求1中所述煙草中噁霜靈檢測用半抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，包括：包被有包被原的酶標(biāo)板、噁霜靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液、噁霜靈抗體、酶結(jié)合物濃縮液、酶結(jié)合物稀釋液、底物顯色液、終止液、洗滌液。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述包被原為噁霜靈偶聯(lián)抗原，所述酶結(jié)合物為酶標(biāo)記的噁霜靈抗體，所述噁霜靈抗體是由免疫原免疫動物得到的，所述噁霜靈偶聯(lián)抗原是由噁霜靈半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述噁霜靈半抗原是由噁霜靈與巰基丙酸等物...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王兆芹，惠光朋，張瑜，萬宇平，楊海濤，崔海霞，馬永慧，
申請(專利權(quán))人：北京望爾生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：