本發明專利技術公開了一種鍍金免疫磁微球修飾方法及其在免疫分析中的應用，提出了一種鍍金免疫磁微球修飾方法，可用于電化學發光免疫分析中；相較于不導電的磁微珠，該方法突破了低氧化電位路徑的電化學發光原理的限制，將電化學發光光強提高了近20倍，顯著地提高了電化學發光效率；結合電化學發光成像技術，實現了基于粒徑分辨的多重免疫分析方法，相較于羅氏診斷，該方法提高了檢測通量。該方法提高了檢測通量。該方法提高了檢測通量。
【技術實現步驟摘要】
一種鍍金免疫磁微球修飾方法及其在免疫分析中的應用
[0001]本專利技術屬于醫學診斷
，具體涉及一種鍍金免疫磁微球修飾方法及其在免疫分析中的應用。
技術介紹
[0002]電化學發光是由電化學反應引起的發光過程，因此不受光漂白和自熒光的影響。由于其背景低、靈敏度高、響應速度快、時空可控等特點，電化學發光在從基礎研究到商業臨床和生物學應用的多個領域內成為一種多功能和強大的分析技術。
[0003]目前已經實現商業化的電化學發光方法包括羅氏（Roche）診斷和Meso Scale Discovery（MSD）。其中羅氏診斷是將發光分子通過免疫夾心反應標記在磁微球的表面，實現對疾病標志物的檢測。受低氧化電位路徑的電化學發光原理的限制，該方法存在的問題是：（1）采用的磁微珠是不導電的，電化學發光效率低；（2）采用的設備是電子倍增管，收集的是所有磁珠的ECL，造成一次只能檢測一種標志物，檢測通量低。（3）采用的磁微珠粒徑多為~2.8 μm，不利于使用電化學發光成像的方法進行免疫分析。
[0004]因此，突破低氧化電位路徑的電化學發光原理限制、開發一種高發光效率的電化學免疫分析方法具有重要的意義。
技術實現思路
[0005]為解決上述問題，本專利技術公開了一種鍍金免疫磁微球修飾方法及其在免疫分析中的應用，突破了低氧化電位路徑的電化學發光原理的限制；相較于不導電的磁微珠，基于導電的鍍金免疫磁微球的電化學發光光強提高了近20倍，顯著地提高了電化學發光效率；結合電化學發光成像技術，實現了基于粒徑分辨的多重免疫分析方法；相較于羅氏診斷，該方法提高了檢測通量。
[0006]為達到上述目的，本專利技術的技術方案如下：一種基于導電的鍍金免疫磁微球修飾方法，具體步驟如下：（1）將鍍金磁微球用等離子體清洗，然后浸泡于3
?
巰基丙酸的乙醇溶液中，并于4 ℃條件下靜置18 h，最后經過超聲分散后收集并洗滌得到羧基功能化的鍍金磁微球；（2）將步驟（1）中得到的羧基功能化的鍍金磁微球用去離子水和嗎啉乙磺酸緩沖液洗滌，然后與羧基活化劑在室溫條件下孵育30 min，經磁分離與洗滌后，得到活化的羧基功能化的鍍金磁微球；（3）將步驟（2）中得到的活化的羧基功能化的鍍金磁微球與捕獲抗體在37 ℃條件下孵育3 h，經過磁分離、洗滌后與6
?
巰基
?1?
己醇在37 ℃條件下孵育1 h，最后經過磁分離后洗滌得到捕獲抗體修飾的鍍金磁微球；（4）將步驟（3）中得到的捕獲抗體修飾的鍍金磁微球與抗原及生物素標記的檢測抗體在37 ℃條件下孵育30 min，經過磁分離、洗滌后與發光分子Ru(bpy)
32+
標記的鏈霉親和素在37 ℃條件下孵育10 min，最后經過磁分離后洗滌得到Ru(bpy)
32+
標記鍍金磁微球。
[0007]作為本專利技術的一種改進，所述步驟（1）中等離子體清洗的條件為空氣氣氛，清洗時間為3 min。
[0008]作為本專利技術的一種改進，所述步驟（1）中3
?
巰基丙酸的乙醇溶液濃度為1 mM。
[0009]作為本專利技術的一種改進，所述步驟（2）中羧基活化劑為含有10 mg/mL的1
?
乙基
?
(3
?
二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和10 mg/mL的N
?
羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽的嗎啉乙磺酸緩沖液。
[0010]作為本專利技術的一種改進，所述步驟（3）中6
?
巰基
?1?
己醇的濃度為1 mM。
[0011]本專利技術還提供了一種由上述方法制得的基于導電的鍍金免疫磁微球。
[0012]本專利技術還有一個目的是提供上述方法制備的基于導電的鍍金免疫磁微球在電化學發光免疫分析中的應用。
[0013]作為本專利技術的一種改進，所述基于導電的鍍金免疫磁微球作為電化學發光免疫分析的載體在提升電化學發光效率中的應用。
[0014]本專利技術的有益效果為：1. 本專利技術的基于導電的鍍金免疫磁微球突破了低氧化電位路徑的電化學發光原理的限制，相較于羅氏診斷中使用的磁珠，鍍金磁微球的電化學發光強度提高了近20倍，顯著地提高了電化學發光效率。
[0015]2. 由于突破了低氧化電位路徑的電化學發光原理的限制，建立了基于粒徑分辨的電化學發光多重免疫分析方法，提高了檢測通量。
附圖說明
[0016]圖1為本專利技術的基于鍍金磁微球與非導電磁珠免疫分析的電化學發光成像圖。
[0017]圖2為本專利技術的基于鍍金磁微球與非導電磁珠免疫分析的電化學發光強度統計圖。
[0018]圖3為本專利技術的基于鍍金磁微球的粒徑分辨多重免疫分析的電化學發光成像圖。
具體實施方式
[0019]下面結合附圖和具體實施方式，進一步闡明本專利技術，應理解下述具體實施方式僅用于說明本專利技術而不用于限制本專利技術的范圍。
[0020]實施例1：基于導電的鍍金免疫磁微球的制備（1）將鍍金磁微球用等離子體清洗，然后浸泡于濃度為1 mM的3
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巰基丙酸的乙醇溶液中，并于4 ℃條件下靜置18 h，最后經過超聲分散后收集并洗滌得到羧基功能化的鍍金磁微球，優選的，等離子體清洗的條件為空氣氣氛，清洗時間為3min；（2）將步驟（1）中得到的羧基功能化的鍍金磁微球用去離子水和嗎啉乙磺酸緩沖液洗滌，然后與羧基活化劑在室溫條件下孵育30 min，經磁分離與洗滌后，得到活化的羧基功能化的鍍金磁微球，優選的，羧基活化劑為含有10 mg/mL的1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和10 mg/mL的N
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羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽的嗎啉乙磺酸緩沖液；（3）將步驟（2）中得到的活化的羧基功能化的鍍金磁微球與捕獲抗體在37 ℃條件下孵育3 h，經過磁分離、洗滌后與濃度為1 mM的6
?
巰基
?1?
己醇在37 ℃條件下孵育1 h，最后經過磁分離后洗滌得到捕獲抗體修飾的鍍金磁微球；
（4）將步驟（3）中得到的捕獲抗體修飾的鍍金磁微球與抗原及生物素標記的檢測抗體在37 ℃條件下孵育30 min，經過磁分離、洗滌后與發光分子Ru(bpy)
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標記的鏈霉親和素在37 ℃條件下孵育10 min，最后經過磁分離后洗滌得到Ru(bpy)
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標記鍍金磁微球。
[0021]實施例2：Ru(bpy)
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標記的鍍金磁微球的電化學發光成像測試：通過免疫夾心反應將發光分子Ru(bpy)
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分別標記在鍍金磁微球（Ru@GMB）和非導電磁珠(Ru@MMB)表面，并分散于磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）。取5 μL分散液滴于玻碳電極表面。在自制的電解池中加入含100 mM 三正丙胺（TPrA）的0.1 M PBS（pH 7.4），施加電位為1.3 V vs A本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種基于導電的鍍金免疫磁微球修飾方法，其特征在于，具體步驟如下：（1）將鍍金磁微球用等離子體清洗，然后浸泡于3
?
巰基丙酸的乙醇溶液中，并于4 ℃條件下靜置18 h，最后經過超聲分散后收集并洗滌得到羧基功能化的鍍金磁微球；（2）將步驟（1）中得到的羧基功能化的鍍金磁微球用去離子水和嗎啉乙磺酸緩沖液洗滌，然后與羧基活化劑在室溫條件下孵育30 min，經磁分離與洗滌后，得到活化的羧基功能化的鍍金磁微球；（3）將步驟（2）中得到的活化的羧基功能化的鍍金磁微球與捕獲抗體在37 ℃條件下孵育3 h，經過磁分離、洗滌后與6
?
巰基
?1?
己醇在37 ℃條件下孵育1 h，最后經過磁分離后洗滌得到捕獲抗體修飾的鍍金磁微球；（4）將步驟（3）中得到的捕獲抗體修飾的鍍金磁微球與抗原及生物素標記的檢測抗體在37 ℃條件下孵育30 min，經過磁分離、洗滌后與發光分子Ru(bpy)
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標記的鏈霉親和素在37 ℃條件下孵育10 min，最后經過磁分離后洗滌得到Ru(bpy)
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標記鍍金磁微球。2.根據權利要求1所述的一種基于導電的鍍金免疫磁微球修飾方法，其特征在于：所述步驟（1）中等離子體清洗的條件為空氣氣氛，清洗時間為3 ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭維亮，杭俊夢，戴志暉，
申請(專利權)人：南京師范大學，
類型：發明
國別省市：
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