畢赤酵母、其制備方法及其在催化蔗糖生產低聚果糖中的應用技術

本發明專利技術公開了一種畢赤酵母，其細胞表面表達如SEQ ID No.7所示的蛋白。還公開了其在催化蔗糖生產低聚果糖中的應用，及其制備方法。本發明專利技術將葡萄糖氧化酶

【技術實現步驟摘要】
畢赤酵母、其制備方法及其在催化蔗糖生產低聚果糖中的應用


[0001]本專利技術涉及一種畢赤酵母、其制備方法及其在催化蔗糖生產低聚果糖中的應用，屬于合成生物學領域。

技術介紹

[0002]現有技術通過單一的表達果糖基轉移酶，將酶分離純化固定后催化蔗糖生產低聚果糖，或者使用2次發酵技術分別表達果糖基轉移酶與葡萄糖氧化酶，然后將果糖基轉移酶與葡萄糖氧化酶分別分離純化固定后共同催化蔗糖生產低聚果糖。單一的表達果糖基轉移酶再將酶分離純化固定后催化蔗糖生產低聚果糖時，在反應過程中會產生葡萄糖副產物，對生產低聚果糖的反應有抑制作用，使得低聚果糖的轉化率很低。在使用2次發酵技術分別表達果糖基轉移酶與葡萄糖氧化酶，然后將果糖基轉移酶與葡萄糖氧化酶分別分離純化固定后共同催化蔗糖生產低聚果糖時，發酵次數多，分離純化步驟繁瑣，使得發酵的效率低成本高。

技術實現思路

[0003]本專利技術的目的是提供一種表面表達葡萄糖氧化酶
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果糖基轉移酶融合酶的畢赤酵母。
[0004]本專利技術采取的技術方案為：
[0005]一種畢赤酵母，其特征在于其細胞表面表達如SEQ ID No.7所示的蛋白。
[0006]本專利技術還公開了上述的畢赤酵母在催化蔗糖生產低聚果糖中的應用。
[0007]優選的，其步驟包括：收集培養的畢赤酵母全細胞，將畢赤酵母全細胞加入蔗糖水溶液中進行反應，制得低聚果糖。
[0008]本專利技術還公開了上述的畢赤酵母的制備方法，其特征在于其步驟包括：
[0009](1)化學合成如SEQ ID No.6所示的融合基因anc
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L
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gody
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ftfx，其中融合基因序列包含畢赤酵母錨定蛋白基因序列、葡萄糖氧化酶基因序列和果糖基轉移酶基因序列，畢赤酵母錨定蛋白基因序列、葡萄糖氧化酶基因序列和果糖基轉移酶基因序列三者以融合基因形式連接，畢赤酵母錨定蛋白基因序列與葡萄糖氧化酶基因序列之間有連接肽序列，葡萄糖氧化酶基因序列與果糖基轉移酶基因序列之間有連接肽序列，融合基因序列兩端包含EcoRI和Not1的酶切位點序列，以及載體pPIC9K的同源臂序列；
[0010](2)將步驟(1)合成的融合基因片段和載體pPIC9K分別經EcoRI和Not1雙酶切；
[0011](3)將酶切后的融合基因片段與酶切后的pPIC9K載體連接，使融合基因構建到載體pPIC9K中；
[0012](4)將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞，篩選出陽性克隆；
[0013](5)培養大腸桿菌感受態細胞陽性克隆，從中抽提出質粒pPIC9K
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anc
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gody
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ftfx；
[0014](6)將質粒pPIC9K
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anc
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ftfx線性化；
[0015](7)將線性化的質粒電轉化入畢赤酵母感受態細胞，篩選出陽性克隆，得到表面表達葡萄糖氧化酶
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果糖基轉移酶融合酶的畢赤酵母。
[0016]優選的，步驟(3)中采用T4 DNA連接酶連接酶切后的融合基因片段與酶切后的pPIC9K載體。
[0017]優選的，步驟(6)中將質粒用SacI酶切線性化。
[0018]本專利技術具有以下有益效果：
[0019]本專利技術將葡萄糖氧化酶
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果糖基轉移酶融合酶展示在畢赤酵母表面，采用該畢赤酵母全細胞催化生產低聚果糖，在生產的同時消除葡萄糖對反應的抑制作用，可以有效提高低聚果糖的轉化率。且本專利技術還發現，表面展示葡萄糖氧化酶
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果糖基轉移酶融合酶的畢赤酵母比果糖基轉移酶
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葡萄糖氧化酶融合酶的畢赤酵母在催化生產低聚果糖時酶活更高，低聚果糖的轉化率更高。因此，本專利技術的畢赤酵母可用于生產低聚果糖并提高低聚果糖的轉化率。
附圖說明
[0020]圖1為本專利技術與現有技術相比的流程對照圖。
[0021]圖2為本專利技術與現有技術相比的低聚果糖轉化率對照圖。圖中標記：A：對比例1中使用表面展示果糖基轉移酶
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葡萄糖氧化酶的畢赤酵母全細胞催化蔗糖產低聚果糖，轉化率約為50％；B：使用實施例1的表面展示葡萄糖氧化酶
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果糖基轉移酶畢赤酵母全細胞催化蔗糖產低聚果糖，轉化率達到60％以上；C：對比例2中單獨使用果糖基轉移酶分離純化固定后催化蔗糖產低聚果糖，低聚果糖轉化率約40％；D：葡萄糖對照；E：低聚果糖標準樣對照；F：蔗糖對照。
具體實施方式
[0022]為更進一步闡述本專利技術為實現預定專利技術目的所采取的技術手段及功效，以下結合附圖及較佳實施例，對依據本專利技術的具體實施方式、結構、特征及其功效，詳細說明如后。附圖1可以展示本專利技術與現有技術相比的流程對照。
[0023]對比例1將融合果糖基轉移酶
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連接肽
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葡萄糖氧化酶展示在畢赤酵母細胞表面的方法及其在全細胞直接催化生產低聚果糖的應用，包括如下步驟：
[0024](1)優化畢赤酵母錨定蛋白基因、葡萄糖氧化酶基因、果糖基轉移酶基因和連接肽的序列，如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；
[0025](2)化學合成如SEQ ID No.5所示的錨定蛋白
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連接肽
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果糖基轉移酶
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連接肽
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葡萄糖氧化酶融合基因anc
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L
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ftfx
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gody；融合基因序列兩端包含EcoRI和Not1酶切位點序列和載體pPIC9K的同源臂序列；
[0026](3)載體pPIC9K均經EcoRI和Not1雙酶切，酶切體系如下：
[0027][0028](4)將帶有同源臂的融合基因片段anc
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L
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ftfx
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L
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gody和酶切后的pPIC9K載體重組，重組體系如下：
[0029][0030](5)將重組產物轉化入大腸桿菌Top10感受態細胞；
[0031](6)涂布含氨芐青霉素的平板；
[0032](7)PCR檢測陽性克隆。菌檢上游引物PF1:CAACCACCATCTCTTCCTTTGC，下游引物PR1:GAGCCACGGAGATGTTCACA；
[0033](8)擴大培養并用質粒小提試劑盒抽提質粒，得到目的質粒p
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anc
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L
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ftfx
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gody；
[0034](9)質粒均用本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種畢赤酵母，其特征在于其細胞表面表達如SEQ ID No.7所示的蛋白。2.權利要求1所述的畢赤酵母在催化蔗糖生產低聚果糖中的應用。3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于其步驟包括：收集培養的畢赤酵母全細胞，將畢赤酵母全細胞加入蔗糖水溶液中進行反應，制得低聚果糖。4.權利要求1所述的畢赤酵母的制備方法，其特征在于其步驟包括：(1)化學合成如SEQ ID No.6所示的融合基因anc
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L
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gody
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ftfx；(2)將步驟(1)合成的融合基因片段和載體pPIC9K分別經EcoRI和Not1雙酶切；(3)將酶切后的融合基因片段與酶切后的pPIC9K載體連接，將融合基因構建到載體pPIC9K中；(4)將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞，篩選出陽性克隆；(5)培養大腸桿菌感受態細胞陽性克隆...

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱佑民，張慧，金玉葉，張文薈，
申請(專利權)人：上海國龍生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：