一種單克隆抗體增量的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種單克隆抗體增量的制備方法，步驟如下：S1，分別制備無血清細(xì)胞培養(yǎng)基、無抗體血清、營養(yǎng)溶液；S2，將S1制備的產(chǎn)物混合制得雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，其中無抗體血清的體積比例為1

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
G中的任意一種。
[0016]作為優(yōu)選，所述步驟S1中還添加有如下濃度的添加劑：轉(zhuǎn)鐵蛋白10
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30mg/L、谷氨酰胺60
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70g/L、油酸20
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30mg/L、亞油酸5
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15mg/L、鈣鹽100
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150mg/L、鋅鹽20
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30mg/L。
[0017]作為優(yōu)選，所述添加劑按1:100的體積比加入培養(yǎng)基中。
[0018]作為優(yōu)選，所述步驟S1中，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中每隔24h添加一次如下濃度的物質(zhì)：丙酮酸鈉10
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20g/L、葡萄糖50
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100mmol/ml。
[0019]本專利技術(shù)的有益效果在于：該專利技術(shù)利用無血清培養(yǎng)基制成雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，然后利用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)了單克隆抗體細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)，提高了產(chǎn)量，有利于各種基于單克隆抗體診斷試劑或試劑盒的開發(fā)和治療藥物產(chǎn)量的提高，極大地節(jié)約了生產(chǎn)成本，降低實驗動物地使用量，提高動物福利，產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益，同時產(chǎn)生的單克隆抗體也具有較高的生物活性，更利于使用。
具體實施方式
[0020]為了更清楚地說明本專利技術(shù)實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合實施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步說明，進(jìn)行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例是本專利技術(shù)的部分實施例，而不是全部實施例。基于本專利技術(shù)的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有付出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術(shù)的保護(hù)范圍。此外，本專利技術(shù)中所提到的方向用語，例如，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“內(nèi)”、“外”等，僅是使用的方向用語是為了更好、更清楚地說明及理解本專利技術(shù)，而不是指示或暗指本專利技術(shù)必須具有的方位，因此不能理解為對本專利技術(shù)的限制。
[0021]本專利技術(shù)實施例，一種單克隆抗體增量的制備方法：一種單克隆抗體增量的制備方法：步驟如下：
[0022]S1，分別制備無血清細(xì)胞培養(yǎng)基、無抗體血清、營養(yǎng)溶液，其中無血清培養(yǎng)基包括完全培養(yǎng)基和不完全培養(yǎng)基中的一種或兩種，所述不完全培養(yǎng)基包括RPMI1640、DEME培養(yǎng)基中的一種，所述完全培養(yǎng)基包括Hybridoma SFM培養(yǎng)基、CD Hybridoma培養(yǎng)基、NCTC
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190培養(yǎng)基中的任意一種，所述無抗體血清是去除血清中IgG抗體后的血清，選擇常用的牛血清來制備；所述營養(yǎng)溶液包括表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、白蛋白、水解物，所述水解物包括酵母水解物和水解植物蛋白，兩者的質(zhì)量比為1:1，所述表皮細(xì)胞生長因子的添加量為10
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30μg/L，所述成纖維細(xì)胞生長因子的添加量為10
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30μg/L，所述白蛋白的添加量為1
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3g/L，所述水解物的添加量為1
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3g/L，這樣的范圍就更利益提高雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞量以及單克隆抗體的表達(dá)量，在實施例中選擇表皮細(xì)胞生長因子的添加量為10μg/L、成纖維細(xì)胞生長因子的添加量為10μg/L、白蛋白的添加量為2g/L、水解物的添加量為1g/L；
[0023]S2，將S1制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基、無抗體血清、營養(yǎng)溶液混合制得雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，其中無抗體血清的體積比例為1
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10％，就實現(xiàn)了雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基在培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞時免訓(xùn)話流程，提高了細(xì)胞的培養(yǎng)效率，減少由于添加高比例血清對于工藝穩(wěn)定性的影響，避免了外源抗體的干擾，培養(yǎng)方法簡單，有效，細(xì)胞培養(yǎng)效果好，抗體表達(dá)量高；
[0024]S3，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基置于容器中，其體積為容器體積的1/10，就便于后續(xù)的補液；
[0025]S4，將新城疫單克隆抗體或萊克多巴胺單克隆抗體接種至雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行
培養(yǎng)，每隔48h，補充1/4容積量雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，直至容器內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基完全滿，進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)；所述新城疫單克隆抗體或萊克多巴胺單克隆抗體是以10
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1000萬/ml的接種密度接種至雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)的；所述培養(yǎng)條件為，培養(yǎng)溫度35
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39℃，二氧化碳的濃度為4％
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10％，轉(zhuǎn)速為110
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260rpm；
[0026]S5，將生產(chǎn)的單克隆抗體用飽和硫酸銨沉淀法或?qū)游鲋ㄟM(jìn)行純化，所述純化采用層析柱法進(jìn)行，其中親和層析柱為Protein A或Protein G中的任意一種,通過純化就提高單克隆抗體的抗體量，比常規(guī)方法抗體量高25倍。
[0027]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟S5之前還需要將生產(chǎn)的單克隆抗體依次通過蛋白芯片和多肽芯片進(jìn)行篩選，蛋白芯片和多肽芯片就通過抗體抗原特異性結(jié)合的原理對相應(yīng)的樣品進(jìn)行檢測、篩選和鑒定，進(jìn)而制備出針對不同抗原和/或不同抗原表位的抗體。
[0028]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟S1中還添加有如下濃度的添加劑：轉(zhuǎn)鐵蛋白10
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30mg/L、谷氨酰胺60
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70g/L、油酸20
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30mg/L、亞油酸5
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15mg/L、鈣鹽100
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150mg/L、鋅鹽20
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30mg/L，其中谷氨酰胺為L
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谷氨酰胺或其衍生物，鈣鹽為氯化鈣、碳酸氫鈣或葡糖糖酸鈣，鋅鹽為氯化鋅或硫酸鋅，各組分所添加的濃度為轉(zhuǎn)鐵蛋白15mg/L、谷氨酰胺60g/L、油酸25mg/L、亞油酸5mg/L、鈣鹽110mg/L、鋅鹽20mg/L，將添加劑配合好后然后依據(jù)所選擇的培養(yǎng)基的體積，按照添加劑對培養(yǎng)基1:100的體積比加入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。其中的轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相互作用，從而與三價鐵離子可逆性結(jié)合，調(diào)節(jié)鐵離子轉(zhuǎn)運和代謝，維持細(xì)胞內(nèi)的鐵平衡，進(jìn)而維持細(xì)胞的生長和增殖，起到一種生長因子的功能，同時其還是一種重要的胞外抗氧化劑，可避免細(xì)胞外環(huán)境中自由基的產(chǎn)生，防止細(xì)胞受到傷害；鈣和鋅則提供細(xì)胞分裂增殖所需的微量元素，從而調(diào)高細(xì)胞增殖效率，進(jìn)而提高細(xì)胞克隆成功率。
[0029]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟S1中，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中每隔24h添加一次如下濃度的物質(zhì)：丙酮酸鈉10
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20g/L、葡萄糖50
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100mmol/ml，丙酮酸鈉和葡萄糖的濃度分別為10g/L、葡萄糖60mmol/ml，它們作為細(xì)胞代謝所需的能量物質(zhì)，在細(xì)胞的三羧酸循環(huán)中，有助于提高細(xì)胞的代謝效率從而提高細(xì)胞的活性，同時由于谷氨酰胺在培養(yǎng)基保存過程中會逐步降解，添加的丙酮酸鈉就有助于培養(yǎng)基營養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，提高增殖能力。
[0030]應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本專利技術(shù)所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
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【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種單克隆抗體增量的制備方法，其特征在于：步驟如下：S1，分別制備無血清細(xì)胞培養(yǎng)基、無抗體血清、營養(yǎng)溶液；S2，將S1制備的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基、無抗體血清、營養(yǎng)溶液混合制得雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，其中無抗體血清的體積比例為1
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10％；S3，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基置于容器中，其體積為容器體積的1/10；S4，將新城疫單克隆抗體或萊克多巴胺單克隆抗體接種至雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔48h，補充1/4容積量雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，直至容器內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基完全滿，進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)；S5，將生產(chǎn)的單克隆抗體用飽和硫酸銨沉淀法或?qū)游鲋ㄟM(jìn)行純化。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述單克隆抗體增量的制備方法，其特征在于:所述無血清培養(yǎng)基包括完全培養(yǎng)基和不完全培養(yǎng)基中的一種或兩種，所述不完全培養(yǎng)基包括RPMI1640、DEME培養(yǎng)基中的一種，所述完全培養(yǎng)基包括Hybridoma SFM培養(yǎng)基、CD Hybridoma培養(yǎng)基、NCTC
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190培養(yǎng)基中的任意一種，所述無抗體血清是去除血清中IgG抗體后的血清。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述單克隆抗體增量的制備方法，其特征在于:所述營養(yǎng)溶液包括表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、白蛋白、水解物，所述水解物包括酵母水解物和水解植物蛋白，兩者的質(zhì)量比為1:1，所述表皮細(xì)胞生長因子的添加量為10
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30μg/L，所述成纖維細(xì)胞生長因子的添加量為10
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30μg/L，所述白蛋白的添加量為1
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3g/L，所述水解物的添加量為1
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3g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述單克隆抗體增量的制備方法，其...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：詹愛軍，張婷，單君憶，
申請(專利權(quán))人：揚州千代科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：