一種SARS-CoV-2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法技術

本發明專利技術屬于新冠病毒抗體滴度的檢測方法，具體地涉及一種使用SARS

【技術實現步驟摘要】
一種SARS
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CoV
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2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法


[0001]本專利技術屬于新冠病毒抗體滴度的檢測方法，具體地涉及一種SARS
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CoV
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2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法。

技術介紹

[0002]新較高的防護標準極大限制了相關研究的開展，而假病毒中和抗體檢測方法（Pseudovirus
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basedneutralizationassays,PBNAs）作為一種替代的、概念驗證性的檢測手段，在疫苗的安全性與有效性評價中有較高的實用價值。
[0003]SARS
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CoV
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2假病毒一般以復制缺陷型的HIV病毒為骨架或以復制缺陷型的VSV
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G病毒為骨架，衣殼包被SARS
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CoV
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2的表面刺突糖蛋白（Spikeglycoprotein），通過Spike蛋白受體結合區域（Receptor
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bindingdomain,RBD）與人血管緊張素轉化酶2（Angiotensinconvertingenzyme2,ACE2）受體糖蛋白復合物結合，感染過表達人ACE2的細胞，模擬病毒入侵細胞過程。由于假病毒只能單次感染，無法復制，因此可在生物安全2級（BSL
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2）實驗室內操作和使用。
[0004]北京維通達生物技術有限公司公開的SARS
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CoV
?/>2假病毒，以HIV病毒為骨架，外面包被SARS
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CoV
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2的Spike蛋白，能夠感染過表達人ACE2的細胞，同時帶有FireflyLuc和EGFP標記，通過FireflyLuc和EGFP檢測感染效率。然而，該技術中假病毒只是用于檢測細胞株（推薦感染hACE2
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Cos7細胞）是否感染假病毒，不是檢測方法，并不能用于表征疫苗后血清中中和抗體活性，無法實現細胞層面定量檢測血清中中和抗體滴度。

技術實現思路

[0005]為了解決上述技術問題，本專利技術公開了一種SARS
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CoV
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2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法。
[0006]本專利技術的技術方案如下：一種SARS
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CoV
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2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法，其特征在于，包括以下步驟：1）在檢測板設空白對照組，病毒對照組，樣品組，設置平行孔；2）對上述的空白對照組，病毒對照組，樣品組進行培養后，分別進行熒光檢測，獲得空白對照組發光強度均值、病毒對照組的發光強度均值和樣品組的發光強度均值；3）計算中和抗體抑制率＝[1－（樣品組的發光強度均值－空白對照組發光強度均值）/（病毒對照組的發光強度均值－空白對照組發光強度均值）]×
100％；4）將上一步算出的中和抗體抑制率輸入統計學軟件進行非線性擬合，計算出中和抗體滴度；所述空白對照中含有hACE2
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Cos7細胞；所述病毒對照中含有SARS
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CoV
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2假病毒和hACE2
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Cos7細胞；所述樣品組中含有SARS
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CoV
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2假病毒、hACE2
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Cos7細胞和待測血清；
所述發光強度均值由以下步驟測定：31）細胞鋪板：D1天在96孔板中每孔接種5000個hACE2
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Cos7細胞，37℃培養過夜；32）樣品稀釋：D1天將待測血清56℃滅活30min，4℃放置過夜，每份40μL；D2天將待測血清做梯度稀釋，血清30μL加稀釋液570μL，加入24孔板第1列，每孔600μL混勻，后五列每孔加450μL稀釋液，排槍將第一列混勻后取150μL加入第二列，依次稀釋至第六列棄去150μL；優選的，上述梯度稀釋比例可選為：1：20、1:80、1:320、1:1280、1：5120、1:20480。
[0007]33）中和檢測病毒感染：D2從
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80℃冰箱中取出SARS
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CoV
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2假病毒冰上融化，樣品組將假病毒與稀釋后的血清按當批病毒對目的細胞的感染復數（MOI）混合，病毒對照組將假病毒與完全培養基混合，37℃孵育1h為混合液；吸去細胞原有培養液，每孔加入100μL配制好的混合液；空白對照組加入100μL完全培養基，輕輕搖勻；4℃，1200g離心感染2h（邊離心邊感染），棄去含有假病毒的培養基，PBS清洗一遍，每孔加入30μL0.25%的胰酶，37℃消化5min,加入100μL完全培養基，排槍輕輕吹打4
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5下重懸均勻，37℃培養過夜；34）細胞換液：D3、D4每天更換培養基，在37℃繼續培養；35）蛋白表達檢測：D5天進行熒光檢測，計算發光強度均值。
[0008]進一步的，上述一種SARS
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CoV
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2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法，所述步驟35）的熒光檢測為Luciferase定量測定。
[0009]進一步的，上述一種SARS
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CoV
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2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法，所述Luciferase定量測定包括以下步驟：1）樣本處理：PBS洗兩次，棄去上清，每孔加入40μL細胞裂解液，冰上裂解15min，裂解過程中間斷吹打混懸以充分裂解，轉移至1.5mLEP管中，10000g離心3min，取上清用于測定。
[0010]2）檢測方法：取20μL樣品加入檢測板中，加入100μL已經溶解并平衡至室溫的螢火蟲熒光素酶檢測試劑，適當混勻。震蕩后室溫孵育5min，使發光信號趨于穩定。使用化學發光檢測儀檢測520nm光波長下的Luciferase信號值。
[0011]優選的，使用的化學發光檢測儀器型號：SpectraMaxL。
[0012]優選的，使用以下試劑盒：Bright
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Lumi
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螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒，貨號為RG051S；螢火蟲螢光素酶報告基因細胞裂解液，貨號為RG126S。
[0013]進一步的，上述一種SARS
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CoV
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2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法，所述SARS
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CoV
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2假病毒來自北京維通達生物技術有限公司，貨號VS
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SC
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0001。
[0014]進一步的，上述一種SARS
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CoV
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2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法，所述SARS
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CoV
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2假病毒以HIV病毒為骨架，外面包被SARS
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CoV
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2的Spike蛋白，能夠感染過表達人AC本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種SARS
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CoV
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2假病毒檢測血清中中和抗體滴度的方法，其特征在于，包括以下步驟：1）在檢測板設空白對照組，病毒對照組，樣品組，設置平行孔；2）對上述的空白對照組，病毒對照組，樣品組進行培養后，分別進行熒光檢測，獲得空白對照組發光強度均值、病毒對照組的發光強度均值和樣品組的發光強度均值；3）計算中和抗體抑制率＝[1－（樣品組的發光強度均值－空白對照組發光強度均值）/（病毒對照組的發光強度均值－空白對照組發光強度均值）]
×
100％；4）將上一步算出的中和抗體抑制率輸入統計學軟件進行非線性擬合，計算出中和抗體滴度；所述空白對照組中含有hACE2
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Cos7細胞；所述病毒對照組中含有SARS
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CoV
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2假病毒和hACE2
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Cos7細胞；所述樣品組中含有SARS
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CoV
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2假病毒、hACE2
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Cos7細胞和待測血清；所述發光強度均值由以下步驟測定：31）細胞鋪板：D1天在96孔板中每孔接種5000個hACE2
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Cos7細胞，37℃培養過夜；32）樣品稀釋：D1天將待測血清56℃滅活30min，4℃放置過夜，每份40μL；D2天將待測血清做梯度稀釋，血清30μL加稀釋液570μL，加入24孔板第1列，每孔600μL混勻，后五列每孔加450μL稀釋液，排槍將第一列混勻后取150μL加入第二列，依次稀釋至第六列棄去150μL；33）中和檢測病毒感染：D2從
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80℃冰箱中取出SARS
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CoV
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2假病毒冰上融化，樣品組將假病毒與稀釋后的血清按當批病毒對目的細胞的感染復數混合，病毒對照組將假病毒與完全培養基混合，37℃孵育1h為混合液；吸去細胞原有培養液，每孔加入100μL配制好的混合液，空白對照組加入100μL完全培養基；輕輕搖勻，4℃，1200g離心感染2h，棄去含有假病毒的培養基，PBS清洗一遍，每孔加入30μL0.25%的胰酶，37℃消化5min,加入100μL完全培養基，排槍輕輕吹打4
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5下重懸均勻，37℃培養過夜；34）細胞換液：D3、D4每天更換培養基，在37℃繼續培養；35）蛋白表達檢測：D5天進行熒光檢測，計算發光強度均值。2.根據權利要求1所述的一種SARS
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CoV
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【專利技術屬性】
技術研發人員：孫麗，曹洋，
申請(專利權)人：昭衍蘇州新藥研究中心有限公司，
類型：發明
國別省市：