本發明專利技術公開了一種閉管可視化檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌的試劑盒及方法，根據鮰愛德華氏菌保守蛋白中的假設蛋白epi18設計引物，在反應體系中通過pH敏感的指示劑，可實現閉管可視化判定靶標基因的目的，該試劑盒檢測靈敏度高，DNA最低檢出率為7.9 copies/μL，特異性強，檢測結果清晰明顯，肉眼觀察即可判斷；也可直接從病魚腦組織直接提取DNA進行快速檢測，相較于原始檢測方法，速度快、可視化程度高，具有良好野外及資源有限的基層實驗室檢測應用的前景。的前景。
【技術實現步驟摘要】
閉管可視化檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌的試劑盒及方法
[0001]本專利技術屬于分子檢測
，具體涉及閉管可視化檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌的試劑盒及方法。
技術介紹
[0002]斑馬魚是國際上應用于科學研究最廣的實驗魚類，其健康狀況和質量是開展一切與斑馬魚相關研究工作的基礎。在斑馬魚室內養殖過程中，各類細菌性疾病的爆發，嚴重制約了以斑馬魚為基礎的相關研究工作的進展。據報道鮰愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)是一種斑馬魚魚房內危害比較嚴重的細菌性病原，一旦在斑馬魚實驗室內爆發，傳播迅速，死亡率高達50％，造成損失巨大，感染存活下來的斑馬魚依舊可以攜帶病原，其糞便經健康魚吞食，或者通過攝食已感染魚尸體而傳染給其它健康魚類造成第二次該類魚病爆發。病魚常表現為魚腹部膨大，口腔、下頜、眼眶、鰓蓋、肛門及鰭條基部等部位明顯充血、出血，頭頂正中部位皮下發紅，頭背部顱側皮膚壞死、潰爛，病情嚴重的頭骨裂開暴露腦組織等癥狀。
[0003]目前，鮰愛德華氏菌的檢測方法有常規的分離培養(分離培養需要至少2天時間)、生理生化鑒定，聚合酶鏈式反應以及16S rDNA測序等。常規方法具有檢測時間長、耗時耗力等缺點；酶聯免疫檢測方法(ELISA)可以快速檢測細菌，但必需先制備相關抗體，步驟繁瑣耗時。PCR技術具有靈敏、特異、快速等優點，廣泛應用于水產養殖病原的檢測中。但PCR技術對實驗人員和環境的要求高，儀器設備貴、操作步驟多。與一般PCR技術相比，熒光PCR檢測技術簡化了操作步驟，而且可消除擴增產物引起的交叉污染，減少假陽性的發生。但實時熒光PCR儀器設備昂貴，無法用于現場檢測。因此，建立快速、準確、靈敏的檢測鮰愛德華氏菌的新方法，對于疾病的早期診斷和預警、實時監測，及時治療具有重要的意義。
[0004]環介導的等溫核酸擴增技術(LAMP)是由Notomi T等人專利技術的新型核酸擴增技術(PMID:10871386)。該技術依賴4條特異設計的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在61
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65℃的恒溫條件下完成反應，避免了類似PCR擴增的變性、退火、延伸等多溫度變化過程，極大地降低了反應設備的生產成本；同時其仍能保留等同于PCR技術的高靈敏度和特異性等優點，在快速檢測領域展示出了巨大的活力。近年來，國內外已將該技術廣泛應用于病原體檢測。
[0005]目前，在其它物種分離的鮰愛德華氏菌檢測中，國外Yeh等已有關于LAMP技術的報道(PMID:16157211)。然而經我們實踐檢測發現上述報道所用引物在斑馬魚源鮰愛德華氏菌檢測中并不工作，且對LAMP結果判定，主要通過瓊脂糖電泳實現，而LAMP擴增產物產量巨大，在開蓋檢測過程極易產生氣溶膠等污染問題導致假陽性結果的出現。2015年有研究報道，在核酸等溫擴增反應過程中，伴隨著靶基因擴增產物的積累過程中，產生了大量的H
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，使反應體系pH下降(PMID:25652028)。因此，可以利用pH敏感的指示劑通過顏色變化以判斷LAMP反應是否發生，從而實現閉管可視化結果判定的目的。目前，尚未見pH指示劑應用于斑馬魚源鮰愛德華氏菌LAMP檢測的相關報道。
技術實現思路
[0006]本專利技術提供了一種閉管可視化檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌的試劑盒及方法，根據鮰愛德華氏菌保守蛋白中的假設蛋白epi18設計設計引物，在反應體系中添加了pH指示劑，可實現閉管可視化判定靶標基因的目的。
[0007]為了實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案：
[0008]用于檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌的LAMP引物組合：外引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，內引物序列如SEQ ID NO.3和4所示。
[0009]檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌的試劑盒，包括序列如SEQ ID NO.1和2所示的外引物，序列如SEQ ID NO.3和4所示的內引物。
[0010]優選地，外引物與內引物的濃度比1：4
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8。
[0011]優選地，上述試劑盒還包括LAMP反應預混液(含pH指示劑)，陽性質粒，所述的陽性質粒為含有鮰愛德華氏菌epi18基因的質粒。
[0012]與現有技術相比，本專利技術具有以下技術效果：
[0013]1、本專利技術建立的斑馬魚源鮰愛德華氏菌LAMP檢測方法特異性強，所用的特異性引物根據文獻報道的鮰愛德華氏菌保守蛋白中的假設蛋白epi18設計，且在反應體系中添加了pH指示劑，以達到閉管可視化判定靶基因是否被有效擴增的效果，可有效避免利用瓊脂糖凝膠電泳、熒光染料等方法引起的假陽性問題。
[0014]2、本專利技術檢測靈敏度高，基因組DNA最低檢出率為7.9copies/μL；檢測時間短，擴增反應只需60min；可以直接從病魚腦組織DNA中直接檢出鮰愛德華氏菌病原，從樣品基因組DNA的提取到完成結果判斷，整個檢測流程僅需70min，比常規分離培養病原，提取病原基因組DNA，再進行PCR等分子或生理生化方法對病原進行確認縮短超過2天時間，大幅度提高檢測速度；儀器設備要求低，無需常規PCR所用的PCR儀、凝膠電泳和成像系統等，只需一個水浴鍋就可完成檢測，操作簡單，結果明顯，整個檢測過程不涉及復雜儀器和設備，稍具分子生物學基礎的人員即可完成操作，檢測結果清晰明顯，肉眼觀察即可判斷，具有良好野外及資源有限的基層實驗室檢測應用的前景。
附圖說明
[0015]圖1為實施例1中樣品檢測結果。1為待檢樣品，2為陽性對照組，3為陰性對照組。
[0016]圖2為實施例2中靈敏度檢測結果。1～6分別是10倍稀釋的基因組模板，對應的模板中靶基因epi18拷貝數分別為7.9
×
105、7.9
×
104、7.9
×
103、7.9
×
102、7.9
×
101、7.9
×
100(copy/μL)，7為陰性對照。
[0017]圖3為實施案例3中采用文獻提供檢測鮰愛德華氏菌引物電泳方法檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌結果。1為DL2000 Marker，2為斑馬魚源鮰愛德華氏菌，3為陰性對照。
[0018]圖4為實施案例3中采用文獻提供檢測鮰愛德華氏菌引物可視化檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌結果。1為斑馬魚源鮰愛德華氏菌，2為陰性對照。
[0019]圖5為實施例3中特異性檢測結果。1～6分別為鮰愛德華氏菌、類志賀氏菌、弧菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、大腸桿菌，標記7為陰性對照。
[0020]圖6為實施例4中斑馬魚病魚腦組織中病原物的LAMP檢測結果。1
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4分別為病原腦組織DNA模板、陽性鮰愛德華氏菌DNA模板、健康魚腦組織DNA模板、無菌水模板。
具體實施方式
[0021]實施例1：LAMP技術檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌的方法的建立
[0022](1)LAMP引物設計：根據文獻報道的鮰愛德華氏菌的保守蛋白epi18基因在NCBI中查找其編碼序列設計外引物為F3a本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.用于檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌的LAMP引物組合，其特征在于，外引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，內引物序列如SEQ ID NO.3和4所示。2.檢測斑馬魚源鮰愛德華氏菌的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物組合。3.根據權利要求2所述的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：柳力月，孫永華，
申請(專利權)人：中國科學院水生生物研究所，
類型：發明
國別省市：
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