本發明專利技術公開鹿膠特征肽及鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法。當采用液相色譜?串連質譜法以電噴霧負離子模式進行多反應檢測時，本發明專利技術的鹿膠特征肽的母離子為732.84，且子離子為875.42、818.40；或者母離子為675.99，且子離子為914.46、746.38。本發明專利技術的鹿膠特征肽能夠辨識、鑒定鹿膠藥材，基于此可建立以特征肽段離子對為指標的高效液相?串聯質譜快速檢測方法(HPLC?MS/MS)。
【技術實現步驟摘要】
鹿膠特征肽及鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法本申請是申請日為2018年9月3日，申請號為CN201811021204.8，專利技術名稱為鹿膠特征肽及鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法的分案申請。
本專利技術屬于醫藥與食品檢測
，具體涉及一種用高效液相-串連質譜技術鑒別鹿膠及其制品真偽的檢測技術。
技術介紹
鹿膠(亦稱鹿皮膠)是由馬鹿CervuselaphusLinnaeus或梅花鹿CervusnipponTemminck的皮經熬制加工而成的特殊中藥材，具有補腎壯陽，補血止血之功效。《本草綱目》中記載“鹿皮無毒，治一切漏瘡，婦女白帶，血崩不止，腎虛滑精”。自古以來鹿膠便是人們滋補養身的功能性保健食品，近些年隨著生活水平的提高，鹿膠藥材及其產品受到了越來越多的關注。由于鹿膠功效顯著，價格較貴，原料又相對短缺，市場上出現了采用其它動物皮或雜皮膠違法生產而成的偽品鹿膠，使得目前市場上鹿膠類藥材的質量參差不齊、市場秩序混亂，甚至出現了劣藥驅逐良藥的惡況。但鹿膠現行的藥材質量標準十分簡單，僅通過鑒別氨基酸類成分或僅通過控制氨基酸成分來進行質量控制，其質量控制缺乏專屬性鑒別方法和高靈敏度的檢測技術，同時由于鹿膠是鹿皮經高溫加熱熬制而成，其蛋白質已變性破壞，常用的動物類藥材鑒定技術DNA-PCR亦無法對此進行鑒別，使得目前鹿膠缺乏有效的真偽鑒別方法。近些年質譜多肽識別技術在動物膠類的鑒定、辨識中的應用越來越廣泛。如程顯隆等在特征肽段檢測技術用于膠類藥材專屬性鑒別方法研究(中國中藥雜志，2015，50(2):104-108)中公開了利用酶切技術及質譜識別技術對阿膠和新阿膠、黃明膠、龜甲膠進行了對比研究，并對特征肽進行檢識，建立了幾種膠類藥材的鑒別方法。CN105842375A公開了一組鑒別阿膠及其制品中驢源性成分的多肽，并利用特征多肽建立了以液質聯用的阿膠及其制品的快速鑒定方法。然而，針對鹿膠藥材及其制品的質譜鑒別研究尚為空白，且國際上蛋白質序列庫中沒有鹿膠原蛋白完整的序列庫，無法進行完整的譜庫檢索。因此，基于質譜建立鑒定鹿膠的方法存在困難。
技術實現思路
為解決現有技術中的至少部分技術問題，本專利技術將鹿膠及其它動物膠進行分析，并進行系統的檢測、比較、驗證后，發現了能夠辨識、鑒定鹿膠藥材的特征性肽段，可以用于鹿膠真偽的鑒別，避免了當前僅用性狀、外觀進行鑒別容易出現假陽性的技術缺陷。具體地，本專利技術包括以下內容。本專利技術的第一方面，提供一種鹿膠特征肽，當采用液相色譜-串連質譜法以電噴霧負離子模式進行多反應檢測時，所述鹿膠特征肽的母離子為732.84，且子離子為875.42、818.40；或所述鹿膠特征肽的母離子為675.99，且子離子為914.46、746.38。根據本專利技術第一方面所述的鹿膠特征肽，優選地，所述液相色譜-串連質譜的條件包括：以C18色譜柱為色譜柱，流動相由流動相A和流動相B組成，且所述流動相A為0.1體積％甲酸水溶液，所述流動相B為乙腈，梯度洗脫為：0-10min，5-50體積％流動相B，10-15min，50體積％的流動相B；質譜為正離子檢測模式，霧化器溫度為350℃，霧化器流速為10L/min，霧化器壓力為35psi，毛細管電壓為3500V，鞘流氣溫度為350℃，鞘流氣流速為12L/min，毛細管電壓為4500V，和錐孔電壓為500V。本專利技術的第二方面，提供一種鹿膠特征肽，其中所述鹿膠特征肽選自序列為SEQIDNo:1或SEQIDNo:2的肽中的至少一種。本專利技術的第三方面，提供一種用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的組合物，其包括本專利技術第一方面或第二方面所述的鹿膠特征肽。本專利技術的第四方面，提供一種用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法，其包括檢測第一方面或第二方面所述的鹿膠特征肽的步驟。根據本專利技術第四方面所述的用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法，其包括以下步驟：(1)待測樣品的處理步驟：取待測鹿膠制品，加銨溶液處理，經胰蛋白酶酶解，C18固相萃取，得到待測樣品溶液；(2)采用液相色譜-串連質譜法以電噴霧負離子模式進行多反應檢測所述待測樣品中是否存在鹿膠特征肽，其中液相色譜-串連質譜法的條件包括以C18色譜柱為色譜柱，流動相由流動相A和流動相B組成，且所述流動相A為0.1體積％甲酸水溶液，所述流動相B為乙腈，梯度洗脫為：0-10min，5-50體積％流動相B、10-15min，50體積％的流動相B，質譜為正離子檢測模式，霧化器溫度為350℃，霧化器流速為10L/min，霧化器壓力為35psi，毛細管電壓為3500V，鞘流氣溫度為350℃，鞘流氣流速為12L/min，毛細管電壓為4500V，和錐孔電壓為500V；(3)如果檢測到母離子為732.84，且子離子為875.42、818.40；或母離子為675.99，且子離子為914.46、746.38，則判定所述待測樣品包含鹿膠制品。根據本專利技術第四方面所述的用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法，其還優選包括以下步驟：(1’)鹿膠對照溶液的制備：取鹿膠作為對照物，加銨溶液處理，經胰蛋白酶酶解，C18固相萃取，得到鹿膠對照溶液；(2’)待測樣品溶液的制備：取待測樣品，以與步驟(1’)相同的方式制備得到待測樣品溶液；(3’)將所述步驟(1’)得到的鹿膠對照溶液與(2’)得到的待測樣品溶液，采用液相色譜-串連質譜法，以電噴霧負離子模式，進行多反應監測，選擇m/z732.84→875.42、818.40，或m/z675.99→914.46、746.38作為檢測離子對進行檢測；(4’)在待測樣品的液相色譜-串聯質譜圖中，如果呈現與所述鹿膠對照色譜保留時間一致的質譜峰，則判定所述待測樣品包含鹿膠；如果不出現相應的質譜峰，則判定所述待測樣品不包含鹿膠。根據本專利技術第四方面所述的用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法，其中所述銨溶液為選自由碳酸氫銨、醋酸銨和甲酸銨組成的組中的一種或幾種物質的水溶液。根據本專利技術第四方面所述的用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法，其中所述胰蛋白酶酶解條件包括酶濃度為每100μl樣品液中含5μg-20μg，酶解溫度為30-40℃，酶解的時間為10-24小時。根據本專利技術第四方面所述的用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法，其中所述多反應監測的裂解電壓為120V，且碰撞能量為35V；或者裂解電壓為100V，碰撞能量為25V。本專利技術的鹿膠特征肽能夠辨識、鑒定鹿膠藥材，基于此可建立以特征肽段離子對為指標的高效液相-串聯質譜快速檢測方法(HPLC-MS/MS)。另外，本專利技術的鑒定方法采用高效液相-串連質譜技術，其檢測的靈敏度高，不僅可以用于單一鹿膠的鑒別，還可以辨別標識含鹿膠的制品中是否含有鹿膠成分，擴大了本技術方法的應用范圍。附圖說明圖1為本專利技術一種示例性鹿膠特征肽的質譜離子圖。圖2為本專利技術另一種示例性鹿膠特征肽的質譜離子圖。圖3為MRM模式下一種示例性鹿膠特征肽的m/z732本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種鹿膠特征肽，其特征在于，當采用液相色譜-串連質譜法以電噴霧負離子模式進行多反應檢測時，所述鹿膠特征肽的母離子為732.84，且子離子為875.42、818.40；或所述鹿膠特征肽的母離子為675.99，且子離子為914.46、746.38。/n
【技術特征摘要】
1.一種鹿膠特征肽，其特征在于，當采用液相色譜-串連質譜法以電噴霧負離子模式進行多反應檢測時，所述鹿膠特征肽的母離子為732.84，且子離子為875.42、818.40；或所述鹿膠特征肽的母離子為675.99，且子離子為914.46、746.38。
2.根據權利要求1所述的鹿膠特征肽，其特征在于，所述液相色譜-串連質譜的條件包括：
以C18色譜柱為色譜柱，流動相由流動相A和流動相B組成，且所述流動相A為0.1體積％甲酸水溶液，所述流動相B為乙腈，梯度洗脫為：0-10min，5-50體積％流動相B，10-15min，50體積％的流動相B；
質譜為正離子檢測模式，霧化器溫度為350℃，霧化器流速為10L/min，霧化器壓力為35psi，毛細管電壓為3500V，鞘流氣溫度為350℃，鞘流氣流速為12L/min，毛細管電壓為4500V，和錐孔電壓為500V。
3.一種鹿膠特征肽，其中所述鹿膠特征肽選自序列為SEQIDNo:1或SEQIDNo:2的肽中的至少一種。
4.一種用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的組合物，其包括根據權利要求1-3任一項所述的鹿膠特征肽。
5.一種用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法，其包括檢測根據權利要求1-3任一項所示的鹿膠特征肽的步驟。
6.根據權利要求5所述的用于鑒定待測樣品中是否包含鹿膠的方法，其包括以下步驟：
(1)待測樣品的處理步驟：取待測樣品加銨溶液處理，經胰蛋白酶酶解，C18固相萃取，得到待測樣品溶液；
(2)采用液相色譜-串連質譜法以電噴霧負離子模式進行多反應檢測所述待測樣品中是否存在鹿膠特征肽，其中液相色譜-串連質譜法的條件包括以C18色譜柱為色譜柱，流動相由流動相A和流動相B組成，且所述流動相A為0.1體積％甲酸水溶液，所述流動相B為乙腈，梯度洗脫為：0-10min，5-50體積％流動相B，10-15min，50體積％的流動相B，質譜...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃勇，鄭云楓，徐浩坤，劉睿，謝宇，
申請(專利權)人：貴州廣濟堂藥業有限公司，
類型：發明
國別省市：貴州;52
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