重組豬肺炎支原體疫苗制造技術

本發明專利技術涉及重組ＤＮＡ或合成方法制得的豬肺炎支原體蛋白，編碼該蛋白的ＤＮＡ序列，含有該ＤＮＡ序列的表達載體和轉化的宿主，基于該蛋白的疫苗，基于該ＤＮＡ序列的疫苗，用該疫苗治療豬以預防地方性動物性肺炎的方法，基于該蛋白或針對該蛋白所產生的抗體的診斷性試驗，以檢測豬群中存在Ｍｈｙｏ感染。（*該技術在2018年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及豬肺炎支原體(Mycoplasma huyopneumoniae,M.hyopneumoniae或Mhyo)，具體涉及一種抗原性Mhyo蛋白。更具體地說，本專利技術涉及一種抵御地方性動物性肺炎、尤其是豬的地方性動物性肺炎而起保護作用的疫苗。
技術介紹
豬的地方性動物性肺炎，也稱為支原體性肺炎，它是由Mhyo引起的。該疾病是一種慢性的非致命性疾病，影響所有年齡的豬。受感染的豬僅僅表現出輕微的咳嗽和發熱癥狀，但是該疾病對于經濟卻有明顯影響，因為它降低了飼料效率，并減少了豬的體重。地方性動物性肺炎通過受感染豬肺部呼出的支原體空氣播散經鼻途徑在豬之間傳播。在最初感染了Mhyo后，豬還可能被其它種類支原體(豬鼻支原體和絮狀支原體)以及其它細菌病原體二次感染。Mhyo是一種小的原核微生物，它能獨立地存活，但是通常發現它與真核細胞結合在一起，因為它絕對需要外源甾醇和脂肪酸。這些需求通常是其在含血清介質中生長所必需的。Mhyo與細胞膜而不是與細胞壁結合。Mhyo的基因組長度約為1000000個堿基對。支原體和宿主細胞表面的物理性結合是地方性動物肺炎發作和持續的基礎。Mhyo感染豬的呼吸道，在氣管、支氣管和細支氣管中定居。該支原體產生一種纖毛靜止(ciliostatic)因子，該因子使呼吸道上的纖毛停止抖動。最終，纖毛退化，使得豬易受第二種病原體感染。在受感染的動物可觀察到愈合的紫色至灰色區域的特征性病損。對宰殺的動物進行調查，顯示30-80％的豬有病損。來自13個州的37個飼養場的結果表明，99％飼養場的豬有地方性動物肺炎之典型肺炎病損癥狀。因此，非常需要有效的預防和治療措施。抗生素如冠截耳素、三甲氧芐二氨嘧啶、四環素和林可霉素具有一定的效果，但是昂貴且需要長期使用。另外，這些抗生素沒有表現出有效根除了Mhyo的傳播或重新感染。預防維持飼養場無病原體有時可行，但是通常會再次引入Mhyo。由于豬肺炎的嚴重的經濟后果，人們已經找到了抗Mhyo的疫苗以及表明存在該感染的診斷性測試方法。含有在含血清培養基中生長的支原體之制劑的疫苗已上市，但是價格昂貴，并且因免疫材料中存在血清成分而會引起副反應。提供疫苗的其它嘗試還未成功，因此該疾病仍十分普遍。因此，需要一種抵抗豬體內支原體感染的疫苗以及一種生產該疫苗的廉價方法。還需要一種診斷性試驗來檢測豬群中是否存在豬支原體感染。專利技術概述本專利技術提供一種純化的或分離的以重組或合成方法制得的豬肺炎支原體蛋白P102，以及作為P102一部分的多肽或肽，當將它們給予豬時，它們誘發產生的抗體能與Mhyo結合。較佳的P102和多肽具有附圖說明圖1所示的氨基酸序列，或該序列的片段。本專利技術還提供用于制備P102和前述多肽的重組DNA分子。較佳的重組DNA分子特征是選自圖2所示序列的DNA序列、編碼圖1和5所示氨基酸序列的DNA序列、與那些DNA序列的任何一個雜交并編碼Mhyo P102的DNA序列、編碼上述任一DNA序列所編碼的Mhyo抗原的DNA序列、和與上述DNA序列遺傳密碼簡并并編碼Mhyo的一個抗原的DNA序列。本專利技術還提供含有這些蛋白或DNA序列的表達載體和宿主細胞。本專利技術還包括一種用于免疫豬抵抗Mhyo感染的疫苗，免疫方法是給予豬(例如通過注射)制得的并隨后分離的P102、多肽、或含有本專利技術DNA序列的表達載體，給予的量應足以引起抗體的形成。本專利技術還提供一種基于本專利技術的P102、多肽或針對它們產生的抗體的診斷性測試，用于測試豬群中的Mhyo感染。本專利技術的其它優點和特征將在本專利技術較佳實施方案的詳細描述、附圖和實施例部分明顯看出。附圖簡述圖1示出了P102的氨基酸序列。圖2示出了編碼Mhyo P102的DNA序列。圖3示出了P97操縱子克隆的限制性圖譜。圖4示出了P102克隆的限制性圖譜。圖5示出了翻譯的P102的氨基酸序列與幾個克隆的序列的序列對比。圖6示出了P97毗連序列群的開放讀框，以及用來篩選基因組文庫的探針。圖7示出了Mhyo DNA與圖6的探針雜交分析的結果。專利技術詳述現在將詳細參看本專利技術的較佳實施方案，結合附圖和下述實施例來解釋本專利技術的原理。這些實施方案描述地非常詳細，足以使本領域技術人員實施本專利技術，并且應當理解在不脫離本專利技術的思路和范圍內還可采用其它實施方案，并作結構上和化學上的變化。在本申請中采用了下列縮略語aa，氨基酸；Ab，抗體；bp，堿基對；CHEF，夾持均相電場(clamped homogenous electric rield)；H，嗜血桿菌；kb，千堿基或1000個堿基對；Kn，卡那霉素；LB，Luria-Bertoni培養基；M，支原體；mAb，單克隆抗體；ORF，開放讀框；PCR，聚合酶鏈反應R，抗性；Tn，轉座子;::，新的接頭(融合物或插入物)。下表1中給出了氨基酸的一個字母和三個字母密碼符號。 用于下文描述的術語“蛋白質”指微生物表達的、用常規方法(如制備性層析，免疫學分離或通過金屬螯合柱)與其它蛋白、全細菌和細胞物質分開、分離或從中純化出來的蛋白質。下文描述中所用的術語“突變體”指具有少量修飾或保守性變化的氨基酸或DNA序列，從而該序列導致蛋白質具有與天然Mhyo P102基本上等價的功能。術語“保守性變化”指一個氨基酸殘基用另一個生物學上相似的殘基來代替，或替換DNA序列中的核苷酸來達到相同的結果。保守性變化的例子包括用一個疏水性殘基(異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)來代替另一個疏水性殘基，或用一個極性殘基來代替另一個極性殘基，例如用精氨酸來代替賴氨酸，用谷氨酸來代替天冬氨酸，或用谷氨酰胺來代替天冬酰胺等。術語“保守性變化”還包括用替換的氨基酸來代替未經替換的親代氨基酸，只要該替換的多肽所產生的抗體也能和未替換的多肽發生免疫反應。本專利技術還涉及分離的、純化的和/或重組體形式的豬肺炎支原體蛋白P102，以及該P102蛋白或其片段作為豬疫苗或診斷工具的應用。本專利技術已經對P102進行了分離、特征分析和命名，專利技術者已顯示出P102能在豬體內引起免疫反應保護豬抵抗毒性攻擊。對應于重組P102的DNA序列、含有該序列的表達載體和宿主也在本專利技術的范圍內。本專利技術還提供一種含有分離的、純化的和/或重組的P102、或編碼P102的DNA序列的疫苗，用于免疫豬以抵抗Mhyo感染，還提供一種基于P102、用于測試豬群中感染的診斷性工具。任何Mhyo菌株均可作為起始材料來制備本專利技術的P102。合適的Mhyo菌株可以從各種來源獲得，包括從保藏機構如美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA)和NRRL培養物保藏中心(Agricultural Research Service,U.S.Department ofAgriculture,Peoria,IL)獲得。單單ATCC就列出6個Mhyo菌株可售。鑒于該疾病的廣泛傳播，還可通過從患病動物的肺分泌物或組織回收Mhyo并接種到合適的培養基中來獲得菌株。現在參看附圖，圖1顯示了Mhyo P102的氨基酸序列。可以看出，P102包含904個氨基酸，從下表2中可以詳細看出氨基酸的分布。P102缺少半胱氨酸，等電點(pI)為9.28。該蛋白質被命名為“P102”是因為它的分子量為102.3千道爾頓。據認本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種蛋白質，它包含圖１所示Ｐ１０２的氨基酸序列的至少一部分，并且具有天然豬肺炎支原體Ｐ１０２的抗原性。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：FC米尼恩，舒昌達，
申請(專利權)人：衣阿華州立大學研究基金會股份有限公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]