本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種體外培植牛黃的質(zhì)量鑒別方法，首先對體外培植牛黃的膽汁酸類成分和膽紅素類成分制定標準指紋圖譜：①制備供試品溶液和對照品溶液，②反相色譜柱測定其高效液相色譜，③對１０批以上供試品溶液的高效液相色譜進行數(shù)據(jù)分析制訂膽汁酸類成分和膽紅素類成分兩種標準指紋圖譜。然后將待測樣品建立高效液相色譜數(shù)據(jù)，與上述的標準指紋圖譜數(shù)據(jù)進行對比、鑒別。本發(fā)明專利技術(shù)用于體外培植牛黃原料和含體外培植牛黃的制劑中體外培植牛黃的質(zhì)量鑒別、鑒定，可以作為區(qū)別體外培植牛黃與天然牛黃、人工牛黃的有效手段。本發(fā)明專利技術(shù)的優(yōu)點是方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握，能從色譜的整體特征面貌上把握體外培植牛黃的品種和質(zhì)量情況。（*該技術(shù)在2024年保護過期，可自由使用*）
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種牛黃的質(zhì)量控制方法，具體的說是利用指紋圖譜來鑒別和控制體外培植牛黃原料或含體外培植牛黃的制劑中體外培植牛黃的質(zhì)量。
技術(shù)介紹
中藥指紋圖譜技術(shù)在國內(nèi)外已成為一種發(fā)展趨勢。中藥指紋圖譜技術(shù)是中藥生產(chǎn)質(zhì)量的一種新型標準，可以確保中藥產(chǎn)品的一致性；也是組分群體的特征圖譜，能全面反映中藥所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而反映中藥材及其產(chǎn)品的質(zhì)量。指紋圖譜獲得的是中藥不同個體的化學(xué)成分信息，用圖形或圖案方式表達，進行比對和分析，可實現(xiàn)對中藥未知物質(zhì)群整體的質(zhì)量控制，是實現(xiàn)多種成分整體相關(guān)質(zhì)量評價的關(guān)鍵技術(shù)，也是中藥創(chuàng)新、研究開發(fā)、質(zhì)量鑒別、鑒定的必要技術(shù)手段。天然牛黃是名貴稀少中藥材，加之瘋牛病的困擾，其來源、產(chǎn)量均非常有限，已遠不能滿足社會需求。因此出現(xiàn)各種替代品，如體外培植牛黃、人工牛黃等，但其主要成分和藥用功效有差距較大。動物藥材的指紋圖譜一向是指紋圖譜研究的難點，現(xiàn)階段以單一化學(xué)成分分析的觀點，不適合牛黃這一復(fù)雜成分分析體系。而解決這一難題的有效手段，就是要借助已被國際社會所認可的中藥指紋圖譜技術(shù)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是通過對市售天然牛黃、體外培植牛黃、人工牛黃等進行研究，提供了一種體外培植牛黃指紋圖譜的研究方法，用于體外培植牛黃原料和含體外培植牛黃的制劑中體外培植牛黃的質(zhì)量鑒別、鑒定，可以作為區(qū)別體外培植牛黃與天然牛黃、人工牛黃的有效手段。本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的，，其特點是(一)體外培植牛黃膽汁酸類成分指紋圖譜的建立a、供試品溶液的制備取10批以上體外培植牛黃細粉或取含體外培植牛黃的制劑細粉，分別精密稱定，分別以20～100ml/g的倍量加入0～5％有機酸水溶液與低碳有機醇的混合溶液，置具塞錐形瓶中超聲提取10～45min，提取液置離心管中，離心，上清液用0.45μm濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得，其中有機酸水溶液與低碳有機醇的體積比為3～10∶90～97，b、對照品溶液的制備取膽酸和去氧膽酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，分別制成每ml含1mg對照品的溶液，c、檢測儀器、試劑高效液相色譜儀，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器，甲醇為色譜純，甲酸、三氟乙酸為分析純，水為超純水，d、色譜條件色譜柱反相色譜柱；流速0.8～1.2ml/min；柱溫25～30℃；進樣量10～20μl；流動相A為0.1％揮發(fā)性有機酸，B為甲醇和乙腈的任意比例，從70％B開始以線性梯度方式經(jīng)70min到達90％B；記錄時間70min，對上述10批以上供試品溶液的高效液相色譜進行數(shù)據(jù)分析制訂體外培植牛黃膽汁酸類成分標準指紋圖譜數(shù)據(jù)，(二)體外培植牛黃膽紅素類成分指紋圖譜的建立a、供試品溶液的制備取10批以上體外培植牛黃細粉或取含體外培植牛黃的制劑細粉，分別精密稱定，分別以20～100ml/g的倍量加入0～5％有機酸水溶液與低碳有機醇的混合溶液，置具塞錐形瓶中超聲提取10～45min，提取液置離心管中，離心，傾去上清液，殘渣同一溶液離心洗至無色，加二甲亞砜10.0ml置具塞錐形瓶中超聲提取10～45min，離心，上清液用0.45μm濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得，其中有機酸水溶液與低碳有機醇的體積比為3～10∶90～97，b、對照品溶液的制備取膽紅素對照品適量，精密稱定，加二甲亞砜適量，制成濃度為0.5mg/ml的膽紅素對照品溶液，c、檢測儀器、試劑、 高效液相色譜儀，d、色譜條件色譜柱反相色譜柱；流速0.8～1.2ml/min；柱溫25～30□；檢測波長451nm；進樣量1～5μl；流動相A為0.1～5％醋酸銨水，B為乙腈/二甲亞砜，其比例為1～5∶5～8，45～55％B等度洗脫；記錄時間20min，對上述10批以上供試品溶液的高效液相色譜進行數(shù)據(jù)分析制訂體外培植牛黃膽紅素類標準指紋圖譜數(shù)據(jù)，(三)將體外培植牛黃原料或含體外培植牛黃的制劑等待測的樣品，以上述相同方法建立高效液相色譜數(shù)據(jù)，與上述的標準指紋圖譜數(shù)據(jù)進行對比、鑒別。本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題還可以通過以下技術(shù)方案來進一步實現(xiàn)，所述的有機酸采用甲酸、乙酸、三氟乙酸、磷酸，其優(yōu)選甲酸；所述的低碳有機醇采用甲醇、乙醇、正丁醇、異丁醇、戊醇，其優(yōu)選甲醇。本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題還可以通過以下技術(shù)方案來進一步實現(xiàn)，體外培植牛黃膽汁酸類成分指紋圖譜色譜優(yōu)選條件為色譜柱反相色譜柱；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃；進樣量為20μl；流動相A為0.1％揮發(fā)性有機酸，B為甲醇和乙腈的任意比例，從70％B開始以線性梯度方式經(jīng)70min到達90％B；記錄時間70min。本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題還可以通過以下技術(shù)方案來進一步實現(xiàn)，體外培植牛黃膽紅素類成分指紋圖譜色譜優(yōu)選條件為色譜柱反相色譜柱；流速為1.0ml/min；柱溫為30□；檢測波長451nm；進樣量為1μl；流動相A為1％醋酸銨水，B為乙腈與二甲亞砜其比例為4∶7，B系統(tǒng)中可以加入10％以下的四氫呋喃作為改性劑，52％B等度洗脫；記錄時間20min。通過本專利技術(shù)的方法建立的體外培植牛黃膽汁酸類ELSD-HPLC指紋圖譜的標準圖譜共有峰為12個。體外培植牛黃膽汁酸類ELSD-HPLC指紋圖譜的標準圖譜數(shù)據(jù) S為參照峰—膽酸(cholic acid)。以本專利技術(shù)的方法、條件測定的體外培植牛黃膽汁酸類ELSD-HPLC指紋圖譜經(jīng)夾角余弦法、或相關(guān)系數(shù)法計算，其與標準圖譜的相似度應(yīng)在0.95-1.0之間。通過本專利技術(shù)的方法建立的體外培植牛黃膽紅素類HPLC指紋圖譜的標準圖譜共有峰為12個。體外培植牛黃膽紅素類HPLC指紋圖譜的標準圖譜數(shù)據(jù)峰號*1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011(S) 12相對保0.154 0.177 0.200 0.225 0.248 0.259 0.293 0.321 0.456 0.7861 1.228留時間相對峰面積比 0.017 0.008 0.013 0.009 0.007 0.012 0.008 0.002 0.043 0.0361 0.042值以本專利技術(shù)的方法、條件測定的體外培植牛黃膽紅素類HPLC指紋圖譜經(jīng)夾角余弦法、或相關(guān)系數(shù)法計算，其與標準圖譜的相似度在0.95-1.0之間。具體實施例方式實施例1，(一)體外培植牛黃膽汁酸類成分指紋圖譜標準的研究方法1、供試品溶液的制備取10批體外培植牛黃細粉或取含體外培植牛黃的制劑細粉0.2g，分別精密稱定，分別加入0～5％甲酸水溶液與甲醇的混合溶液(v∶v＝5∶95)10.0ml，置具塞錐形瓶中超聲提取10～45min，提取液置離心管中，離心，上清液用0.45μm濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。2、對照品溶液的制備取膽酸(cholic acid)和去氧膽酸(deoxycholic acid)對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，分別制成每ml含1mg對照品的溶液。3、檢測方法(儀器、試劑、色譜條件)高效液相色譜儀(例如Agilent 1100系列，含二元高壓泵、自動進樣系統(tǒng)、在線脫氣、柱溫箱等單元。)檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器(例如Alltech 500ELSD)。甲本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種體外培植牛黃的質(zhì)量鑒別方法，其特征在于， （一）體外培植牛黃膽汁酸類成分指紋圖譜的建立 ａ、供試品溶液的制備 取１０批以上體外培植牛黃細粉或取含體外培植牛黃的制劑細粉，分別精密稱定，分別以２０～１００ｍｌ／ｇ的倍量加入０～５％有機酸水溶液與低碳有機醇的混合溶液，置具塞錐形瓶中超聲提取１０～４５ｍｉｎ，提取液置離心管中，離心，上清液用０．４５μｍ濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得， 其中有機酸水溶液與低碳有機醇的體積比為３～１０∶９０～９７， ｂ、對照品溶液的制備 取膽酸和去氧膽酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，分別制成每ｍｌ含１ｍｇ對照品的溶液， ｃ、檢測儀器、試劑 高效液相色譜儀，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器， 甲醇為色譜純，甲酸、三氟乙酸為分析純，水為超純水， ｄ、色譜條件 色譜柱：反相色譜柱；流速：０．８～１．２ｍｌ／ｍｉｎ；柱溫：２５～３０℃；進樣量：１０～２０μｌ；流動相：Ａ為０．１％揮發(fā)性有機酸，Ｂ為甲醇和乙腈的任意比例，從７０％Ｂ開始以線性梯度方式經(jīng)７０ｍｉｎ到達９０％Ｂ；記錄時間：７０ｍｉｎ， ｅ、對上述１０批以上供試品溶液的高效液相色譜進行數(shù)據(jù)分析制訂體外培植牛黃膽汁酸類成分標準指紋圖譜數(shù)據(jù)。 （二）體外培植牛黃膽紅素類成分指紋圖譜的建立 ａ、供試品溶液的制備 取１０批以上體外培植牛黃細粉或取含體外培植牛黃的制劑細粉，分別精密稱定，分別以２０～１００ｍｌ／ｇ的倍量加入０～５％有機酸水溶液與低碳有機醇的混合溶液，置具塞錐形瓶中超聲提取１０～４５ｍｉｎ，提取液置離心管中，離心，傾去上清液，殘渣同一溶液離心洗至無色，加二甲亞砜１０．０ｍｌ置具塞錐形瓶中超聲提取１０～４５ｍｉｎ，離心，上清液用０．４５μｍ濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得， 其中有機酸水溶液與低碳有機醇的體積比為３～１０∶９０～９７， ｂ、對照品溶液的制備 取膽紅素對照品適量，精密稱定，加二甲亞砜適量，制成濃度為０．５ｍｇ／ｍｌ的膽紅素對照品溶液， ｃ、檢測儀器、試劑、 高效液相色譜儀， ｄ、色譜條件 色譜柱：反相色譜柱；流速：０．８～１．２ｍｌ／ｍｉｎ；柱溫：２５～３０□；檢測波長：４５１ｎｍ；進樣量：１～５μｌ；流動相：Ａ為０．１～５％醋酸銨水，Ｂ為乙腈／二甲亞砜，其比例為１～５∶５～８，４５～...
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：凌婭，丁崗，李明慧，盛龍生，
申請(專利權(quán))人：江蘇中康藥物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：32[中國|江蘇]
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