一種檢測(cè)樣品中靶細(xì)胞或病毒的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供快速并靈敏地鑒定醫(yī)學(xué)、工業(yè)、和環(huán)境樣品中的細(xì)胞和病毒靶的有效方法。本發(fā)明專利技術(shù)標(biāo)記靶，然后利用大面積成像檢測(cè)它們。基于本發(fā)明專利技術(shù)的診斷試驗(yàn)是快速、超靈敏、定量、多路、且自動(dòng)化的。該試驗(yàn)可使樣品制備減到最少，而且無(wú)需核酸擴(kuò)增或細(xì)胞培養(yǎng)。本試驗(yàn)可檢測(cè)多種細(xì)胞和病毒。基于本發(fā)明專利技術(shù)的試驗(yàn)可提供核酸擴(kuò)增試驗(yàn)的高水平靈敏度，用戶容易掌握使用，而且可提供免疫測(cè)定法的速度，以及由微生物試驗(yàn)提供的低成本及量化。本發(fā)明專利技術(shù)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有診斷技術(shù)的最佳特征，同時(shí)解決了診斷系統(tǒng)中的缺陷。（*該技術(shù)在2022年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

技術(shù)介紹
本專利技術(shù)涉及醫(yī)學(xué)、工業(yè)、或環(huán)境樣品中細(xì)胞和病毒的鑒定。概述檢測(cè)、計(jì)算、和鑒定低水平的特定細(xì)胞及病毒是常規(guī)醫(yī)學(xué)、工業(yè)、和環(huán)境診斷的基礎(chǔ)。例如，對(duì)樣品進(jìn)行分析從而檢測(cè)感染劑，癌細(xì)胞，食物病原體，藥物和化妝品的微生物污染物，以及水和環(huán)境中的微生物。簡(jiǎn)言之，下面的討論集中在常規(guī)的醫(yī)學(xué)診斷上；類似的方法可用于工業(yè)和環(huán)境應(yīng)用。微生物學(xué)方法微生物培養(yǎng)通過(guò)利用它們迅速大量繁殖的趨勢(shì)而進(jìn)行微生物(例如，細(xì)菌，病毒，和真菌)的簡(jiǎn)單目測(cè)。例如，單一細(xì)菌細(xì)胞因?yàn)樘?約百萬(wàn)分之一米)而不能用內(nèi)眼看到，當(dāng)放在營(yíng)養(yǎng)肉湯中時(shí)，肉湯在24小時(shí)內(nèi)明顯變渾濁。相關(guān)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，也被稱作微生物計(jì)數(shù)或集落計(jì)數(shù)，可量化樣品中的微生物細(xì)胞數(shù)。以原位微生物復(fù)制為基礎(chǔ)的微生物計(jì)數(shù)方法，通常相對(duì)于樣品中的每種微生物細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)可目測(cè)的“集落”。因此，計(jì)算可見(jiàn)集落數(shù)可使微生物學(xué)家準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的微生物細(xì)胞數(shù)。為了進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)，可將細(xì)菌細(xì)胞分散在陪替氏培養(yǎng)皿中營(yíng)養(yǎng)瓊脂(“瓊脂平板”)的表面上，并在可以進(jìn)行原位細(xì)菌復(fù)制的條件下培養(yǎng)。單一的，不可目測(cè)的微生物反復(fù)復(fù)制，在祖代微生物細(xì)胞沉積的位置產(chǎn)生大量相同的子代微生物。子代細(xì)胞持續(xù)與原始細(xì)胞共同-定位(基本相連)，這樣子代細(xì)胞群(它們可生長(zhǎng)至幾千萬(wàn)或幾億個(gè)細(xì)胞)最終在平板上形成肉眼可見(jiàn)的集落。微生物培養(yǎng)是一種非常成功的方法，這是因?yàn)榧词乖谝粋€(gè)多世紀(jì)后，該方法仍然支配著醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和工業(yè)微生物學(xué)中的質(zhì)量控制試驗(yàn)(例如，藥物，食品，和飲料的制造)。該方法便宜，相對(duì)簡(jiǎn)單，而且超-靈敏。微生物培養(yǎng)的靈敏度可在絞細(xì)牛肉中的食源性病原體的普通試驗(yàn)中觀察到。單一顯微細(xì)菌病原體細(xì)胞可利用微生物培養(yǎng)，在25g絞細(xì)牛肉中檢測(cè)。微生物培養(yǎng)的其它優(yōu)點(diǎn)是其檢測(cè)各種具有醫(yī)學(xué)和工業(yè)重要性的微生物的能力。某些病毒可在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。病毒培養(yǎng)已經(jīng)特別用于研究中的速生噬菌體(感染細(xì)菌的病毒)。病毒培養(yǎng)有時(shí)用于診斷臨床感染，盡管現(xiàn)在正越來(lái)越多地使用核酸擴(kuò)增替代該方法。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)較慢—它要花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間來(lái)產(chǎn)生病毒檢測(cè)所需數(shù)量的細(xì)胞或病毒。微生物培養(yǎng)所需的較長(zhǎng)生長(zhǎng)周期是保健和工業(yè)中的重要問(wèn)題。例如，因?yàn)樗枰獛滋鞎r(shí)間來(lái)培養(yǎng)并鑒定導(dǎo)致患者血液感染的微生物，因此真菌血液感染的患者甚至可能在開(kāi)始抗-真菌治療之前就已經(jīng)死亡。某些感染劑，如引起肺結(jié)核的細(xì)菌，通常需要在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)幾周。檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌所需的較長(zhǎng)時(shí)間可導(dǎo)致肺結(jié)核患者感染很多其它高度傳染性的疾病，或?qū)е聸](méi)有肺結(jié)核的患者在檢疫期的花費(fèi)較高。在食物的制造中，較長(zhǎng)的試驗(yàn)周期可能增加食物變質(zhì)。緩慢的微生物培養(yǎng)還會(huì)不利地影響生物藥和疫苗的生產(chǎn)。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了很多更快速進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的微生物培養(yǎng)方法。其中一種較為快速的方法可使細(xì)菌細(xì)胞沉積在涂覆了營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的顯微鏡載玻片上。利用顯微鏡檢查，可比用肉眼更早地檢測(cè)微生物生長(zhǎng)，這是因?yàn)轱@微鏡可檢測(cè)由于少數(shù)細(xì)胞分裂產(chǎn)生的小菌落。商業(yè)化系統(tǒng)Colifast Rapid Microcolony Counter(Colifast)可在肉眼看到之前幾小時(shí)檢測(cè)少量熒光標(biāo)記的大腸埃希氏菌集落。Colifast系統(tǒng)利用包含在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的熒光化合物(非熒光的，直到被大腸埃希氏菌代謝的物質(zhì))提高檢測(cè)。利用生物發(fā)光標(biāo)記快速計(jì)算微生物集落數(shù)的系統(tǒng)近來(lái)已經(jīng)商業(yè)化。MicroStar系統(tǒng)(Millipore)利用小菌落中的細(xì)胞ATP，經(jīng)由所用熒光素酶和底物的作用產(chǎn)生光。該方法可大大減少檢測(cè)時(shí)間。MicroStar成像系統(tǒng)已經(jīng)與標(biāo)記探針聯(lián)合用于鑒定特定的細(xì)菌(Stender，H.等，(2001)J.Microbiol Methods 4669-75)。免疫學(xué)方法免疫學(xué)試驗(yàn)，或免疫測(cè)定法，在醫(yī)學(xué)診斷中常常用于鑒定特定的細(xì)胞和病毒。免疫測(cè)定法可檢測(cè)抗體與靶和病毒分子成分上的位點(diǎn)的特異性結(jié)合。血清學(xué)試驗(yàn)屬于免疫測(cè)定法，它不是直接測(cè)試抗原，而是測(cè)試宿主對(duì)先前與抗原接觸的免疫應(yīng)答—例如，它們可測(cè)試宿主對(duì)特定細(xì)胞和病毒的抗體的存在。有很多免疫測(cè)定系統(tǒng)都可使用，例如從大型自動(dòng)化中心實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，到可直接進(jìn)行的合法妊娠試驗(yàn)。該試驗(yàn)包括多種形式，如凝集測(cè)定法，沉淀素測(cè)定法，酶聯(lián)免疫測(cè)定法，直接發(fā)熒光測(cè)定法，免疫-組織學(xué)試驗(yàn)，補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定法，血清學(xué)試驗(yàn)，免疫-電泳測(cè)定法，和快速“帶狀”試驗(yàn)(例如，側(cè)流和流通試驗(yàn))。免疫學(xué)試驗(yàn)可以非常簡(jiǎn)單而且快速。因此，絕大多數(shù)理想試驗(yàn)，例如可在醫(yī)生辦公室或由患者在家進(jìn)行的那些，是免疫學(xué)試驗(yàn)。基因方法基因方法是用于檢測(cè)并鑒定細(xì)胞和病毒中核酸分子的普通且有效的工具。近來(lái)已經(jīng)發(fā)展了以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)、超靈敏檢測(cè)并區(qū)別細(xì)胞和病毒的核酸含量的革命性新方法。例如，商業(yè)試驗(yàn)可檢測(cè)少數(shù)亞顯微HIV病毒粒子的核酸(例如，50個(gè)粒子/ml)。擴(kuò)增技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，和滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。擴(kuò)增法可提供令人印象深刻的分析靈敏度，而且中等快速，例如，Smart Cycler(Cepheid)可在一小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果(Belanger，S.D.等，(2002)Journal of ClinicalMicrobiology 401436-40)。顯微成像方法顯微成像是檢測(cè)細(xì)胞和病毒的一種最普遍的方法。例如，通過(guò)用染料，抗體，或核酸探針標(biāo)記，可在顯微鏡下觀察靶。顯微分析的靈敏度可利用如催化報(bào)道基因沉積(CARD)的方法來(lái)提高，其已經(jīng)用于檢測(cè)人細(xì)胞中單一拷貝水平的病毒基因組(Huang，C.C.等，ModernPathology 11971-7，1998)。用于增加原位雜交靈敏度的其它方法依賴于原位擴(kuò)增或復(fù)制，或利用，例如，支鏈DNA的信號(hào)擴(kuò)增或dendrimer技術(shù)(例如，Orentas，R.J.等，Journal of Virological Methods 77153-63，1999)。多重?zé)晒鈽?biāo)記可用于使用原位分析立刻檢測(cè)多種病原體。例如，不同類目(category)特異性抗原的抗體可用不同的熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。組合標(biāo)記策略也已經(jīng)與顯微鏡檢查聯(lián)合用于同時(shí)鑒定多種細(xì)菌病原體(Amann，R.等，Journal Of Bacteriology 1783496-500，1996；美國(guó)專利號(hào)第6,007,994)。人們已經(jīng)研究出了很多商業(yè)系統(tǒng)，它們可獲得高流通量的顯微靶的原位顯微鏡分析(例如，WO 98/22618和WO 93/21511)。通常，微生物或細(xì)胞沉積于載玻片上或多孔平板的孔底。然后使孔中的標(biāo)記靶在顯微鏡下成像。非-顯微成像方法非-顯微成像可測(cè)量較大面積中細(xì)胞的存在。例如，HamamatsuCorporation(Masuko，M.等，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 67231-8，1991；Masuko，M.等，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 65287-90，1991；Yasui，T.等，Appl Environ Microbiol 634528-33，1997)的研究人員研制了一種不用放大即可使單一細(xì)菌細(xì)胞成像的系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用了與光學(xué)纖維系統(tǒng)連接的超靈敏光子-計(jì)數(shù)CCD照相機(jī)，像增強(qiáng)器，和像-處理器。Elisa斑點(diǎn)試驗(yàn)方法是一種專門用于計(jì)算產(chǎn)生特定抗體(或其它大本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)樣品中靶細(xì)胞或病毒的方法，其中所述靶ａ．在至少兩個(gè)正交維數(shù)中的測(cè)量值小于５０微米，且ｂ．隨機(jī)分散在檢測(cè)區(qū)中，該檢測(cè)區(qū)包括一個(gè)密度小于１００個(gè)靶細(xì)胞／ｍｍ↑［２］的檢測(cè)面積，其中所述方法包括下列步驟：ａ ．照射所述靶細(xì)胞，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，并ｂ．利用小于或等于２０倍的放大率同時(shí)檢測(cè)所述檢測(cè)面積一部分中的信號(hào)，其中所述部分的最長(zhǎng)線性尺寸大于１ｍｍ。

【技術(shù)特征摘要】
...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D斯特勞斯，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：基因描繪系統(tǒng)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：US[美國(guó)]