本發明專利技術涉及一株具有促生作用和廣譜防病效果的橘灰青霉菌株及其菌劑，所述橘灰青霉為橘灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)44M?3，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC NO：M 2019768。利用橘灰青霉菌株制備成高孢粉菌劑，使用時將高孢粉用0.05％(v/v)吐溫80無菌水重懸，不同濃度的孢子懸浮液蘸根或灌根處理植株根部。本發明專利技術的橘灰青霉對多種作物上的病原真菌均有良好抑制作用；橘灰青霉高孢粉懸浮液對玉米、小麥、棉花、芝麻、黃瓜和煙草根部和植株的生長均有促進作用；同時該菌劑具備良好的生物安全性，且生物制劑不會產生抗藥性、農藥殘留、環境污染等化學農藥常見問題，對人畜健康、環境友好，符合生態農業，綠色環保的需求。
A strain of Penicillium cinerea with the function of disease prevention and growth promotion and its fungicide and Application
【技術實現步驟摘要】
一株具有防病促生功能的橘灰青霉及其菌劑和應用
本專利技術涉及一株能夠防治多種病害且具有促生作用的橘灰青霉及其應用，屬于微生物
技術介紹
我國對農作物的病害防治長期依賴化學農藥，導致農藥過量使用，可能會造成環境污染和食品農藥殘留，給人類健康帶來潛在危害。使用對人體和生態環境無害的微生物制劑及其代謝產物，可以減少化學農藥施用，已成為世界范圍內的發展方向。生物農藥因其具有環境友好、對人畜安全、長效、無殘留等優點，在控制病害的發生與蔓延上備受青睞。目前研究較多的生防微生物是芽孢桿菌、假單胞菌、酵母菌、鏈霉菌和木霉等。關于青霉菌作為生防菌防治植物病害的報道較少，研究發現淡紫擬青霉菌菌株對棉花枯萎病的發生及蔓延具有一定控制作用；淡紫擬青霉菌株NH-PL-03的胞內、外多糖對尖孢鐮刀菌的菌絲生長及孢子萌發均有明顯抑制作用。關于橘灰青霉的報道，主要是將其作為發酵菌株，有研究發現橘灰青霉是豆醬發酵過程中產脂肪酶的優勢菌株和產生α-淀粉酶的優勢種群，尚未有對橘灰青霉促生防病效果及其應用進行系統研究的報道。
技術實現思路
本專利技術提供一株具有促生作用和廣譜防病效果的橘灰青霉菌株及其菌劑和應用。為了實現上述目的，本專利技術所采用的技術方案是：一株具有防病促生功能的橘灰青霉，所述的橘灰青霉為橘灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)44M-3，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址：武漢大學保藏中心，保藏編號：CCTCCNO：M2019768，保藏日期：2019年09月30日。一種利用橘灰青霉菌株制備高孢粉菌劑的方法，包括以下步驟：將橘灰青霉接種于PDA培養基上，在25℃、8h光照/16h黑暗的恒溫培養箱中光暗交替培養5-7d，用0.05％(v/v)吐溫80無菌水洗脫孢子，形成孢子懸浮液，將PDB培養液分裝到300mL的三角瓶中，每瓶分裝200mL，每瓶接5mL孢子懸浮液，180r/min，28℃搖床培養4d，作為固體發酵培養的種子液，備用；稱取1500g小麥，蒸餾水浸泡8h后，撈出控水，分裝到真菌培養袋中，每袋100g，121℃，滅菌30min；每袋接種10mL種子液，平鋪使麥子均勻浸潤種子液，置于28℃黑暗恒溫培養箱中培養7-10d；待固體發酵培養基充分產孢時，將固體發酵物平鋪到鋪有一層無菌紙的搪瓷盤中，蓋上一層無菌紙，放置在陽光可照射的玻璃窗前晾5-7d，晾干后，用BFQ100真菌孢子分離器收集孢子粉，形成高孢粉菌劑，高孢粉菌劑中橘灰青霉的孢子含量為1.96×109CFU/g。所述的PDA培養基：去皮馬鈴薯200g，切塊后放入蒸餾水中煮10min，然后過6層紗布過濾，在濾液中加葡萄糖20g，瓊脂15～20g，加蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌30min；PDB培養液為：去皮馬鈴薯200g，切塊后放入蒸餾水中煮10min，然后過6層紗布過濾，在濾液中加葡萄糖20g，加蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌30min。所述的高孢粉菌劑的使用方法，將高孢粉用0.05％(v/v)吐溫80無菌水重懸，并使用血球計數板計數調整孢子濃度，不同濃度的孢子懸浮液蘸根或灌根處理植株根部。一種用于橘灰青霉菌株產抑菌活性物質的培養液，該培養液配方為：蔗糖30g，蛋白胨5g，KCl0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸餾水1000mL。一種所述的橘灰青霉在抑制小麥、煙草、芝麻、地黃和桂花病害的病原菌生長方面的應用。一種所述的橘灰青霉在促進玉米、小麥、棉花、芝麻、黃瓜和煙草生長方面的應用。一種所述的橘灰青霉在防治芝麻枯萎病方面的應用。一種所述的橘灰青霉防治芝麻枯萎病的方法，用0.05％(v/v)吐溫80配制橘灰青霉菌株的孢子懸浮液，其中孢子濃度為1×107CFU/mL；在芝麻幼苗期時使用孢子懸浮液對芝麻進行灌根處理。本專利技術的有益效果：1.本專利技術提供一種促生能力強且防病譜廣的青霉生物制劑，通過形態鑒定以及序列進化分析，鑒定該青菌為橘灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)。2.本專利技術的橘灰青霉對多種作物上的病原真菌均有良好的抑制作用。試驗表明：對芝麻、煙草、小麥、桂花、地黃多種作物上的病原真菌均有良好的抑菌作用，平均抑菌率達59％。其中對串珠霉的抑菌率最高(75.00％)，其次依次為禾谷絲核菌(69.34％)、尖孢鐮刀菌(來自芝麻，63.67％)和球黑孢(63.64％)，說明該橘灰青霉分離菌具有廣譜抑菌活性。3.本專利技術制備得到的橘灰青霉的高孢粉菌劑，孢子含量達109CFU/g；其高孢粉懸浮液對玉米、小麥、棉花、芝麻、黃瓜和煙草根部和植株的生長均有促進作用。4.采用本專利技術的橘灰青霉菌株得到的孢子懸浮液，能夠有效降低枯萎病的發病率，對芝麻枯萎病的防效可達85.25％，與枯萎病防治常用化學農藥多菌靈1000X稀釋液的防效相當。5.本專利技術的橘灰青霉菌株可溶解多種難溶無機磷，分泌嗜鐵素和IAA，IAA產量可達29.3μg/mL，可分泌蛋白酶、纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶。6.本專利技術篩選的橘灰青霉挑戰接種玉米、小麥、棉花、芝麻、黃瓜和煙草后，6種作物均能正常生長，根部和植株均無任何發病癥狀，表明其對作物沒有致病性，具備良好的生物安全性，且生物制劑不會產生抗藥性、農藥殘留、環境污染等化學農藥常見問題，對人畜健康、環境友好，符合生態農業，綠色環保的需求。附圖說明圖1為菌株44M-3與14種病原真菌平板共培養的試驗結果，圖中CK表示對照。圖2為菌株44M-3對芝麻枯萎病的防治效果圖。圖3為菌株44M-3IAA產量測定結果圖。圖4為菌株44M-3發酵培養液的碳氮源優化圖。圖5為菌株44M-3形態特征和顯微特征圖，其中“+”表示平板正面，“-”表示平板反面，A和B為分生孢子梗，C為分生孢子。圖6為菌株44M-3的β-tubulin和Calmodulin序列的系統發育進化樹，其中A圖為β-tubulin序列的進化樹，B圖為Calmodulin序列的進化樹；A中Eupenicilliumosmophilum為外群；B中Eupenicilliumsinaicum為外群；括號中的編號代表菌株在NCBI的登錄號。具體實施方式以下結合實施例對本專利技術的具體實施方式作進一步詳細說明。實驗材料：菌株來源：橘灰青霉44M-3，分離自河南省三門峽市澠池縣峪峒村的土壤樣品。該橘灰青霉為橘灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)44M-3，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址：武漢大學保藏中心，保藏編號：CCTCCNO：M2019768，保藏日期：2019年09月30日。孟加拉紅培養基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，1/3000(w/v)孟加拉紅溶液100mL，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一株具有防病促生功能的橘灰青霉，其特征在于，所述的橘灰青霉為橘灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)44M-3，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址：武漢大學保藏中心，保藏編號：CCTCC NO：M 2019768，保藏日期：2019年09月30日。/n
【技術特征摘要】
1.一株具有防病促生功能的橘灰青霉，其特征在于，所述的橘灰青霉為橘灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)44M-3，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址：武漢大學保藏中心，保藏編號：CCTCCNO：M2019768，保藏日期：2019年09月30日。
2.一種利用橘灰青霉菌株制備高孢粉菌劑的方法，其特征在于，包括以下步驟：
將橘灰青霉接種于PDA培養基上，在25℃、8h光照/16h黑暗的恒溫培養箱中光暗交替培養5-7d，用0.05％(v/v)吐溫80無菌水洗脫孢子，形成孢子懸浮液，將PDB培養液分裝到300mL的三角瓶中，每瓶分裝200mL，每瓶接5mL孢子懸浮液，180r/min，28℃搖床培養4d，作為固體發酵培養的種子液，備用；
稱取1500g小麥，蒸餾水浸泡8h后，撈出控水，分裝到真菌培養袋中，每袋100g，121℃，滅菌30min；每袋接種10mL種子液，平鋪使麥子均勻浸潤種子液，置于28℃黑暗恒溫培養箱中培養7-10d；
待固體發酵培養基充分產孢時，將固體發酵物平鋪到鋪有一層無菌紙的搪瓷盤中，蓋上一層無菌紙，放置在陽光可照射的玻璃窗前晾5-7d，晾干后，用BFQ100真菌孢子分離器收集孢子粉，形成高孢粉菌劑，高孢粉菌劑中橘灰青霉的孢子含量為1.96×109CFU/g。
所述的PDA培養基：去皮馬鈴薯200g，切塊后放入蒸餾水中煮10min，然后過6層紗布過濾，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉新濤，趙新貝，倪云霞，趙輝，劉紅彥，千慧敏，何碧珀，王婧，張春艷，
申請(專利權)人：河南省農業科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：河南;41
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