一種納豆激酶的生產菌株及其生產方法技術

本發明專利技術涉及一種納豆激酶的生產菌株及其生產方法。具體地，本發明專利技術涉及一種可生產納豆激酶的新菌種，納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtils?natto)ST?1086，其以CGMCC?No.17895保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明專利技術還涉及應用本發明專利技術的新菌株CGMCC?No.17895生產納豆激酶產品的方法，所得納豆激酶產品可以用作溶解血栓的藥品。本發明專利技術還涉及本發明專利技術的納豆激酶產品用于制備用于溶解血栓的組合物的用途以及用于治療血栓的方法。

A production strain of Nattokinase and its production method

【技術實現步驟摘要】
一種納豆激酶的生產菌株及其生產方法
本專利技術涉及微生物發酵領域。具體地，本專利技術涉及一種納豆激酶的生產菌株及納豆激酶產品的生產方法。
技術介紹
納豆激酶為國際上公認的用于人類心腦血管疾病的預防、保健和治療的最重要的活性分子之一，為納豆枯草芽孢桿菌發酵所產生的微量活性物質。多年來，已廣泛應用于食品、膳食補充劑和國內的保健品市場。納豆激酶膳食補充劑原料國際國內市場需求量巨大。目前國際范圍內納豆激酶主要產地有日本、美國和中國臺灣。日本產的納豆激酶由納豆枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)發酵納豆中提取，活性為10000-22000FU/g，相當于67000-147400IU/g。在日本，主要有四個廠家生產納豆激酶：納百恩、生物科技、大和及本田下屬一個子公司。生產納豆激酶最早、產量最大的是生物科技公司，占據了中國臺灣和日本的大部分市場。大和公司生產的納豆激酶粉末，在日本也占據一定的市場份額。這兩家的納豆激酶原料自用不對外銷售。生物科技公司以及大和公司使用的技術老、產品功效單一、缺少粘物質的保護、容易失活、穩定性差，但成本低廉。本田下屬子公司基本同生物科技，擁有納豆激酶專利。日本納百恩公司是生產納豆激酶后起之秀，納豆激酶產品的活性達到22000FU/g，相當于147400IU/g，但價格昂貴。中國臺灣產納豆激酶的技術來源于日本。美國產納豆激酶由曲霉菌發酵物提取，產品中不含納豆菌和維生素K2等粘物質，可稱為“溶栓酶”。文獻報道，利用納豆枯草芽孢桿菌進行液態發酵，納豆激酶的產量為3232IU/ml(相當于482.4FU/ml)(參見熊強等人，納豆激酶液態發酵條件的研究，生物加工過程，2012年，第10卷第4期，第26-29頁)。在中國，納豆產業正處于快速發展階段，新鮮納豆以及以納豆提取粉為主要原料的復合飲料、糖果、餅干及保健食品等納豆系列食品成為一大消費熱點。但是，由于納豆激酶不穩定，純化過程易變性，目前獲得納豆激酶純品非常困難，目前國內外尚未有納豆激酶純品或其制劑銷售，也未有納豆激酶的藥品。因此，本專利技術旨在提供一種生產、純化納豆激酶的方法，解決納豆激酶開發成藥品的關鍵技術難題。
技術實現思路
為了克服現有技術的不足和滿足市場需求，本專利技術的目的在于提供一種可以產生納豆激酶的新菌種。本專利技術人經過多年大量深入細致地研究，從市售新鮮納豆中分離納豆枯草芽孢桿菌菌株，以其作為出發菌株，誘變出一種新的納豆枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)ST1086，該誘變菌株以CGMCCNo.17895保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期：2019年6月5日。本專利技術人從市售新鮮納豆中分離菌株，得到產納豆激酶的菌種ST102。以ST102菌株作為出發菌株，進行紫外誘變，紫外誘變50代后得到形態變異株ST1086，納豆激酶產量提高11倍。以上形態變異以及納豆激酶的產量經數代傳代培養較穩定。本專利技術提供的新菌株CGMCCNo.17895具有以下微生物學特性：革蘭氏陽性菌，芽孢中間生，芽孢大小0.6～0.8μm×1.0～1.5μm，菌體寬1μm，長2-3μm。在LB瓊脂培養基上，菌落表面飽滿、褶皺、白，凸起，能拉絲，菌落直徑0.3-0.5cm，無色素，菌體培養10小時出現芽孢。在本專利技術的一個方面，提供了應用本專利技術的新菌株CGMCCNo.17895生產納豆激酶產品的方法，包括在培養基中培養本專利技術的菌株CGMCCNo.17895以在所述培養基中產生納豆激酶。培養可以在本領域常規或已知的裝置和條件下進行，例如可以使用搖瓶在本領域常規或已知的轉速下進行；也可以在常規的發酵罐中進行，例如5L發酵罐、5T發酵罐。在一些實施方案中，培養基包含碳源物質和氮源物質，且所述碳源物質與所述氮源物質的比為10:1～1:2。在一些實施方案中，碳源物質選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖和甘油中的一種或多種，氮源物質選自酵母粉、蛋白胨、黃豆粉和鷹嘴豆粉中的一種或多種。在又一些實施方案中，培養基還包含促進微生物的生長和提高納豆激酶的產率的有機物、無機物、或有機物和無機物的混合物。在一些實施方案中，有機物為絲氨酸、甘氨酸、和丙氨酸中的一種或多種，無機物為鎂鹽或鈉鹽。優選地，無機物為硫酸鎂、氯化鎂、氯化鈉。在另一些實施方案中，培養在35-45℃，優選37-40℃進行。在一些實施方案中，培養持續10-48小時，優選12-24小時。根據一些實施方案，所述方法包括在發酵過程中補加碳源物質或氮源物質，或碳源物質和氮源物質的混合物。在一些實施方案中，所述方法還包括以下步驟：(1)固液分離，以分離菌體和上清液；(2)用超濾膜分離，得到納豆激酶濃縮液，所述超濾膜的分子量范圍優選在1000～50000D之間，更優選在10000～30000D之間；(3)用1mmol/LNaCl溶液洗滌，使所述納豆激酶濃縮液的電導率≤300μs/cm，優選≤200μs/cm，更優選≤100μs/cm；以及(4)干燥，所述干燥優選為噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥。在一些實施方案中，固液分離使用本領域常規或已知的固液分離方法進行，諸如陶瓷膜分離或離心。在一些實施方案中，在干燥步驟中加入保護劑，所述保護劑優選為大豆蛋白粉、膠原蛋白粉、膳食纖維、微晶纖維素、玉米淀粉或者其組合物，更優選為5-25％的大豆蛋白粉和2.5-12.5％膳食纖維。根據一些實施方案，通過本專利技術的方法得到的納豆激酶產品的活性為6.5萬-75萬FU/g，相當于43.6萬IU/g-502.5萬IU/g。在另一個方面，本專利技術還提供了由本專利技術的新菌株CGMCCNo.17895發酵培養的培養液制備納豆激酶產品的方法。在一些實施方案中，所述方法包括以下步驟：(1)固液分離，所述固液分離使用本領域常規或已知的固液分離方法進行，諸如陶瓷膜分離、離心，以分離菌體和發酵上清液；(2)用超濾膜分離，得到納豆激酶濃縮液，所述超濾膜的分子量范圍優選在1000～50000D之間，更優選在10000～30000D之間；(3)用等滲鹽溶液洗滌，使所述納豆激酶濃縮液的電導率≤300μs/cm，優選≤200μs/cm，更優選≤100μs/cm；以及(4)干燥，所述干燥優選為噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥。在一些實施方案中，在干燥過程中加入本領域常規的或者已知的保護劑，例如大豆蛋白粉、膠原蛋白粉、膳食纖維、微晶纖維素、玉米淀粉或者其組合物，優選5-25％的大豆蛋白粉和2.5-12.5％膳食纖維。采用本專利技術的菌種CGMCCNo.17895及本專利技術的發酵方法，周期短16-24小時，產量高達12000IU/ml(相當于1791.0FU/ml)，最終納豆激酶產品活性在6.5萬～75萬FU/g，且在制劑工藝過程更加穩定。具體實施方式下面將通過實施例對本專利技術做進一步描述，這些描述并不是對本
技術實現思路
做進一步限定。本領域的技術人員應理解，對本專利技術技術特征所做的等同替換，或相應改進，仍屬于本專利技術的保護范圍之內。在本專利技術中，納豆激酶活性通過以下方法測定。納豆激酶活性的測定方法(一)試液1.PBS(phosphatebuffersaline，磷酸緩沖鹽溶液)緩沖液：0.01mol/L磷酸鹽緩本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtils?natto)菌株，所述納豆枯草芽孢桿菌菌株以CGMCC?No.17895保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

【技術特征摘要】
1.一種納豆枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilsnatto)菌株，所述納豆枯草芽孢桿菌菌株以CGMCCNo.17895保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2.一種生產納豆激酶產品的方法，所述方法包括在培養基中培養根據權利要求1所述的納豆枯草芽孢桿菌菌株以在所述培養基中產生納豆激酶。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述培養基包含碳源物質和氮源物質，且所述碳源物質與所述氮源物質的比為10:1～1:2。4.根據權利要求3所述的方法，其中所述碳源物質選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖和甘油中的一種或多種。5.根據權利要求3和4中任一項所述的方法，其中所述氮源物質選自酵母粉、蛋白胨、黃豆粉和鷹嘴豆粉中的一種或多種。6.根據權利要求2-5中任一項所述的方法，其中所述培養基還包含促進微生物的生長和提高納豆激酶的產率的有機物、無機物、或有機物和無機物的混合物。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述有機物為絲氨酸、甘氨酸、和丙氨酸中的一種或多種。8.根據權利要求6或7所述的方法，其中所述無機物為鎂鹽或鈉鹽，所述無機物優選為硫酸鎂、氯化鎂、氯化鈉。9.根據權利要求2-8中任一項所述的方法，其中培養在35-45℃，優選37-40℃進行。10.根據權利要求2-9中任一項所述的方法，其中培養持續10-48小時，優選12-24小時。11.根...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳杰鵬，段麗麗，洪琳，紀燁瑜，陳鴻銳，蔡春麗，胡留松，許志鍇，陳煜藩，
申請(專利權)人：廣東雙駿生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44