一種基于原核表達諾如病毒抗原表位的亞單位疫苗及其制備方法技術

本發明專利技術涉及生物醫藥領域，尤其是基于原核表達諾如病毒抗原表位亞單位疫苗的制備方法。本發明專利技術提供了一種原核表達的亞單位疫苗，用于刺激機體產生對抗諾如病毒的特異性抗體，其特征在于諾如病毒重組抗原序列為SEQ?ID??NO:1，來源：NCBI?Reference?Sequence:NC_029646.1，人諾如病毒GII型的中和表位：105bp，表達載體為：改造過的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）基因克隆于pThioHisA表達載體。

【技術實現步驟摘要】
一種基于原核表達諾如病毒抗原表位的亞單位疫苗及其制備方法
本專利技術涉及生物醫藥領域，尤其是基于原核表達諾如病毒抗原表位亞單位疫苗的制備方法。
技術介紹
諾如病毒(Norovirus,NoV)是人類急性胃腸炎的主要病原,由于其所引起的胃腸炎具有明顯的季節性,曾在1929年被稱為“冬季嘔吐病”。諾如病毒基因型別的復雜和諾如病毒型間的快速變異,使得諾如病毒疫苗的研制進程緩慢,迄今為止,尚無穩定有效的可供大規模接種的疫苗,亦無安全穩定的抗毒血清用以緊急防護高危暴露人群。諾如病毒屬于杯狀病毒科(Calicivirus)諾瓦克病毒屬，病毒RNA包含3個可讀框(openreadingframes,ORFs)。諾如病毒根據其RNA多聚酶和衣殼蛋白序列同源性差異可分為7個基因組:GroupI(GI)-GroupVII(GVII)。其中，GI,GII,GIV主要感染人和非人類靈長類動物,GIII主要感染牛和羊，GV感染鼠，GVI主要感染狗。根據諾如病毒ORF2全基因序列相似性，GⅠ可進一步分為14個基因型(genotypes)，GⅡ可分為27個基因型。對編碼病毒衣殼蛋白的VP1序列的分析研究表明，不同基因組間的差別在50％以上，而同一基因組的不同基因型間差異高達40％。目前，對于諾如病毒的感染沒有有效的抗病毒藥物，預防諾如病毒感染最有效的措施還是研發針對性的疫苗。諾如病毒的體外培養一直是制約諾如病毒疫苗的一個重要因素，同時沒有合適的動物模型也是制約傳統疫苗研發較的關鍵，雖然最新研究表明，可以通過人的小腸干細胞來源的腸道樣組織實現諾如病毒的體外培養，但是腸道樣組織很難建立和維持，并不適合于傳統大批量疫苗研發、生產所需，所以基因工程疫苗便成為了諾如病毒疫苗研發的最佳選擇。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供了一種原核表達的亞單位疫苗，用于刺激機體產生對抗諾如病毒的特異性抗體。一種基于原核表達諾如病毒抗原表位的亞單位疫苗，其特征在于諾如病毒重組抗原序列為SEQIDNO:1，來源：NCBIReferenceSequence:NC_029646.1，人諾如病毒GII型的中和表位：105bp。表達載體為：改造過的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)基因克隆于pThioHisA表達載體。基于原核表達諾如病毒抗原表位亞單位疫苗的制備方法，包括載體構建、誘導表達、諾如病毒重組抗原的純化等過程，其特征在于諾如病毒重組抗原的純化具體如下：步驟1、硫酸銨鹽析法初步純化重組蛋白將獲得的超聲上清液，按每1ml上清液加入0.243g硫酸銨進行40％硫酸銨沉淀，室溫沉淀30min，期間上下顛倒混勻，8000rpm,4℃離心30min，棄掉上清，沉淀用PB重懸，獲得的蛋白液體凍存至-80℃保存；所取的各個蛋白樣品加入等體積的2×LoadingBuffer，金屬浴100℃煮10min；將上述獲得的表達產物樣品經12％的SDS-PAGE進行分離鑒定；步驟2、離子交換層析純化重組蛋白將Q-FF離子交換凝膠柱安裝于蛋白質分離純化系統中；用PB緩沖液(PH值為8)對Q-FF離子交換凝膠柱進行平衡，上樣，分別用20％、40％、60％、80％、100％的NaCl溶液進行洗脫收取樣品；所取的各個蛋白樣品加入等體積的2×LoadingBuffer，金屬浴100℃煮10min；將上述獲得的表達產物樣品經12％的SDS-PAGE進行分離鑒定。本專利技術的諾如病毒重組抗原序列針對于GII型諾如病毒特異性強、靈敏度高、可用于諾如病毒型別之間的鑒定。改造過的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)基因克隆于pThioHisA表達載體，該載體允許插入外源蛋白具有很好的免疫原性優勢。與現有的畢赤酵母菌系統表達諾如病毒相比，本專利技術應用原核系統表達諾如病毒蛋白，操作簡單，在疫苗開發等領域有著明顯的優勢。附圖說明圖1鑒定重組質粒瓊脂糖電泳分析結果圖圖2鑒定誘導蛋白的可溶性分析結果圖圖3鑒定重組蛋白純化分析結果圖圖4純化結果WB檢測結果圖圖5ELISA效價檢測圖具體實施方式1材料1.1諾如病毒重組抗原序列設計來源：NCBIReferenceSequence:NC_029646.1人諾如病毒GII型的中和表位：105bp。具體序列如下：GGATCCAACCACGTGTGGAACATGCAGGTTGGTGGCGGTGGCAGCGCGAAGTTCACCCCGAAACTGGGTGCGATCCAAATTGGCACCTGGGAGGAAGACGAATTC下劃線部分為鏈接肽1.2酶名稱備注BamHⅠ購自NEB公司EcoRⅠ購自NEB公司T4鏈接酶購自NEB公司1.3載體1.4試劑與試劑盒1.5儀器名稱備注搖床購自北京市六一儀器廠，型號為WD-9405B型電泳儀購自美國BIO-RAD公司，型號為200/2.0PowerSupply超聲破碎儀購自寧波新芝有限公司，型號為JY92-IIN水浴鍋購自一恒科學儀器有限公司，型號為DK-8D凝膠成像儀購自Bio-Rad公司，型號為UniversalHoodⅡ超凈臺購自安泰空氣技術有限公司，型號為SW-CJ-2F金屬浴購自上海藍豹實驗儀器有限公司，型號為TU-10Q-FF離子交換凝膠柱購自GEhealthcare公司離心機購自Hitachi公司，型號為CR21G2方法2.1載體構建2.1.1合成質粒用無菌水溶解后，將其轉化進DH5a感受態細菌。2.1.2挑單克隆接種于約5ml具有氨芐青霉素抗性的LB培養基中，37℃，220rpm/min，振蕩培養過夜，從獲得的細菌中提取帶有NOV片段的質粒。2.1.3將獲得的質粒應用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對其分別進行雙酶切獲得目的片段和載體。2.1.437℃水浴2h，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在長波紫外燈下切下目的片段，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化目的片段。獲得的目的片段，可直接應用于后續的連接實驗。2.1.5測定目的片段及NP載體片段的濃度，分別為：NOV:950ng/ul；NP：850ng/ul。NP載體片段與目的的片段以質量比1：4.5進行連接，連接反應體系如下：2.1.616℃反應12-16h，將連接產物轉化進DH5a細菌后涂布到具有氨芐卡那霉素的LB平板上，倒置培養過夜。2.1.7挑單克隆接種于約5ml具有氨芐青霉素抗性的LB培養基中，37℃，220rpm/min，振蕩培養過夜。之后從獲得的細菌培養液中提取NP-NOV質粒。2.1.8獲得質粒后，應用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對其分別進行雙酶切鑒定，酶切反應體系如下：2.1.937℃水浴中反應2h后對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。2.2誘導表達2.2.1將帶有鑒定正確質粒的細菌接種于5ml具有氨芐青霉素抗性的LB培養基中，37℃，220rpm/min，振蕩培養過夜。2.2.2將菌液按5％轉接至新的LB液體培養基內，培養至菌液OD600值為0.4-0.6時，加入濃度為1mM的IPTG誘導4h。取未加誘導劑的菌液1ml，之后加入濃度為1mM的IPTG進行誘導4h，之后取誘導4h后的菌液1ml，12，000rpm，4℃離心5min，傾倒上清液，獲得的菌體沉淀用0.02M的PB重懸。2.2.3將重懸液進行超聲破碎：30min，每次超聲10s，間隔10s，功率為20％。超聲破碎后的菌液本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種基于原核表達諾如病毒抗原表位的亞單位疫苗，其特征在于諾如病毒重組抗原序列為SEQ?ID?NO:1，來源?：NCBI?Reference?Sequence:?NC_029646.1，人諾如病毒GII型的中和表位：105bp。

【技術特征摘要】
1.一種基于原核表達諾如病毒抗原表位的亞單位疫苗，其特征在于諾如病毒重組抗原序列為SEQIDNO:1，來源：NCBIReferenceSequence:NC_029646.1，人諾如病毒GII型的中和表位：105bp。2.如權利要求1所述的基于原核表達諾如病毒抗原表位的亞單位疫苗，其特征在于表達載體為：改造過的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）基因克隆于pThioHisA表達載體。3.一種基于原核表達諾如病毒抗原表位亞單位疫苗的制備方法，包括載體構建、誘導表達、諾如病毒重組抗原的純化等過程，其特征在于諾如病毒重組抗原的純化具體如下：步驟1、硫酸銨鹽析法初步純化重組蛋白將獲得的超聲上清液，按每1ml上清液加入0.243g硫酸銨進行40%硫酸銨沉淀，室溫沉淀3...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李鴻鈞，劉洋，林曉晨，周艷，吳晉元，解裕萍，
申請(專利權)人：中國醫學科學院醫學生物學研究所，
類型：發明
國別省市：云南,53