單管巢式PCR反應體系和擴增方法技術

本發明專利技術涉及基因工程及分子生物學領域，提供了一種單管巢式PCR反應體系，其包括雙鏈DNA模板、外引物對和內引物對，所述外引物從5’端到3’端包括互補序列和靶區結合序列，所述靶區結合序列遠離互補序列的末端與所述互補序列的堿基互補，所述外引物用于在第一退火溫度下對變性解鏈的DNA模板擴增并獲得中間產物，所述內引物用于在第二退火溫度下對變性解鏈的中間產物擴增并獲得目標產物，所述外引物在第二退火溫度下形成引物雙鏈結構。本發明專利技術還提供一種單管巢式PCR擴增方法，本發明專利技術的單管巢式PCR反應體系和擴增方法，保證了單管擴增后目標產物的純度較高。

Single Tube Nested PCR Reaction System and Amplification Method

The present invention relates to the field of genetic engineering and molecular biology, and provides a single-tube nested PCR reaction system, which includes double-stranded DNA template, external primer pair and internal primer pair. The external primer includes complementary sequence and target binding sequence from 5'to 3'. The target binding sequence is far from the end of complementary sequence and base complementation of the complementary sequence. The internal primer is used to amplify the intermediate product of the denatured chain at the second annealing temperature and obtain the target product. The external primer forms a primer double-chain structure at the second annealing temperature. The invention also provides a single tube nested PCR amplification method. The single tube nested PCR reaction system and amplification method of the invention ensure that the purity of the target product after single tube amplification is high.

【技術實現步驟摘要】
單管巢式PCR反應體系和擴增方法
本專利技術涉及基因工程及分子生物學領域，更具體地說，涉及一種單管巢式PCR擴增方法。
技術介紹
聚合酶鏈式反應(PCR)是用于擴增DNA鏈的特定區域的技術。DNA鏈可以是單個基因、基因的僅僅一部分或非編碼序列。大部分PCR方法通常擴增多達10k堿基對(kilobasepair，kb)的DNA片段，但一些技術允許擴增大小達40kb的片段(Cheng等，1994，ProcNatlAcadSci.91：5695-5699)。現有技術為提高PCR擴增特異性提供了一種巢式PCR擴增方法。巢式PCR擴增反應在兩個接連的反應中使用兩組不同引物。在一擴反應中，使用第一引物對靶標區域DNA片段進行一階段PCR擴增產生中間產物，該中間產物可能還含有從非靶標區域擴增的產物。然后將中間產物用于起始二擴反應，所述二擴反應使用第二引物對靶標區域DNA片段進行二階段PCR擴增產生目標產物。通常，第二引物對的結合位點位于第一引物對以內。巢式PCR通常在一個試管中進行一擴反應，然后將中間產物的等分試樣轉移到第二試管中進行二擴反應。現有技術巢式PCR擴增方法的中間產物在兩個試管之間移轉會增加擴增產物對環境的污染，甚至導致后續試驗結果出現嚴重偏差。因此，急需一種單管巢式PCR擴增方法，用于消除現有技術巢式PCR擴增方法的技術問題。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種單管巢式PCR擴增方法，用于克服雙管巢式PCR擴增方法的技術問題。一種單管巢式PCR反應體系，其包括雙鏈DNA模板、外引物對和內引物對，所述外引物從5’端到3’端包括互補序列和靶區結合序列，所述靶區結合序列遠離互補序列的末端與所述互補序列的堿基互補，所述外引物用于在第一退火溫度下對變性解鏈的DNA模板擴增并獲得中間產物，所述內引物用于在第二退火溫度下對變性解鏈的中間產物擴增并獲得目標產物，所述外引物在第二退火溫度下形成引物雙鏈結構。進一步的，所述引物雙鏈結構包括引物發卡結構或引物二聚體結構。進一步的，所述外引物對包括第一外引物和第二外引物，所述引物雙鏈結構為第一外引物和第二外引物之間形成的雙鏈結構。進一步的，所述外引物對包括第一外引物和第二外引物，所述引物發卡結構包括第一外引物或第二外引物自身形成的雙鏈結構。進一步的，所述第一退火溫度的范圍可以是65-72℃，所述第二退火溫度的范圍是50-62℃。進一步的，所述第一退火溫度為65度，所述第二退火溫度為52度。一種單管巢式PCR擴增方法，其包括：建立反應體系，所述反應體系中包括雙鏈DNA模板、外引物對和內引物對，所述外引物從5’端到3’端包括互補序列和靶區結合序列，所述靶區結合序列遠離互補序列的末端與所述互補序列的堿基互補；進行一擴反應，在第一退火溫度下通過外引物對實現對變性解鏈的DNA模板擴增并獲得中間產物；進行二擴反應，在第二退火溫度下通過內引物對中間產物擴增并獲得目標產物，所述外引物在第二退火溫度形成引物雙鏈結構。進一步的，所述引物雙鏈結構包括引物發卡結構或引物二聚體結構。進一步的，所述外引物對包括第一外引物和第二外引物，所述引物雙鏈結構為第一外引物和第二外引物之間形成的雙鏈結構。進一步的，所述外引物對包括第一外引物和第二外引物，所述引物發卡結構包括第一外引物或第二外引物自身形成的雙鏈結構。相對于現有技術，本專利技術單管巢式PCR擴增方法構建的反應體系中，外引物的5’端包括互補序列，其在二擴反應階段較低退火溫度例如52℃時，會相互自連接形成引物雙鏈結構，所述引物雙鏈結構可以是引物發卡結構，例如第一外引物之間形成的二聚體或第二外引物之間形成的二聚體，也可以是引物之間二聚體，例如第一外引物和第二外引物之間形成的二聚體。因此二擴反應階段只有內引物對才可正常工作對中間產物進行擴增形成目標產物。本專利技術的單管巢式PCR擴增方法反應體系構建簡單，反應過程無需將中間產物重新分裝，不僅減少了現有技術巢式PCR擴增方法的技術問題，還保證了單管擴增后目標產物的純度較高。附圖說明圖1為本專利技術單管單管巢式PCR擴增方法的反應原理圖。圖2為實驗一結果的PAGE膠電泳圖。圖3為實驗二結果的PAGE膠電泳圖。圖4為實驗三結果的PAGE膠電泳圖。具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。請參考圖1，本專利技術提供一種單管巢式PCR擴增方法，包括以下步驟：S1，建立反應體系，所述反應體系包括雙鏈DNA模板、外引物對和內引物對。所述外引物從5’端到3’端包括互補序列和靶區結合序列，所述靶區結合序列遠離互補序列的末端與所述互補序列的堿基互補。所述外引物的靶區結合序列用于在第一退火溫度下對變性解鏈的DNA模板擴增形成中間產物，所述內引物用于在第二退火溫度下對變性解鏈的中間產物擴增形成目標產物，所述外引物對的互補序列用于在第二退火溫度下與靶區結合序列形成引物雙鏈結構,所述引物雙鏈結構可以是引物發卡結構，也可以是引物二聚體結構。本實施例中，S1步驟構建的反應體系可以制成單管巢式PCR擴增試劑盒。S2，進行一擴反應，在第一退火溫度下通過外引物對對變性解鏈的DNA模板擴增，獲得中間產物。本實施例中，所述第一退火溫度高于60度，較佳地，所述第一退火溫度的范圍可以是65-72℃。S3,進行二擴反應，在第二退火溫度下通過內引物對對變性解鏈的中間產物模板擴增，獲得目標產物，所述外引物的互補序列和靶區結合序列在第二退火溫度下形成引物雙鏈結構。本實施例中，所述第二退火溫度的范圍可以是50-62℃，較佳地，所述第二退火溫度比第一退火溫度低10-15℃。本實施例中，所述外引物的互補序列和靶區結合序列形成引物雙鏈結構的溫度范圍可以是45-57℃，較佳地，所述外引物的互補序列和靶區結合序列形成引物雙鏈結構的溫度比內引物對的第二退火溫度低0-5℃。一實施例中，以擴增MTHFR基因rs1801133位點的片段為例，分別提供三種外引物對進行實驗對照。第一外引物對用于現有技術巢式PCR的反應體系，其包括第一外引物SEQIDNO:1、第二外引物SEQIDNO:2，第一引物對的第一外引物SEQIDNO:1和第二外引物SEQIDNO:2沒有設置互補序列。第一引物對引物序列及工作退火溫度可參考下表1。第二外引物對用于本專利技術單管巢式PCR擴增的一個實施例，其包括第一外引物SEQIDNO:3、第二外引物SEQIDNO:4，第一外引物SEQIDNO:3和第二外引物SEQIDNO:4在第二退火溫度49.5℃下可形成引物二聚體結構，第二外引物對的相關引物序列及工作退火溫度可參考下表2。第二外引物對的引物二聚體結構形成的方式為：所述第一外引物SEQIDNO:3的互補序列GAGTGCTGAG在第二退火溫度49.5℃下與第二外引物SEQIDNO:4的靶區結合序列末端CTCAGCACTC形成引物雙鏈結構。所述第二外引物SEQIDNO:4的互補序列CTTGCACC在第二退火溫度49.5℃下與第一外引物SEQIDNO:3的靶區結合序列末端GGTGCAAG形成引物雙鏈結構。第三外引物對用于本專利技術單管巢式PCR擴增的另一實施例，其包括第一外引物SEQIDNO:5、第二外引物SEQIDNO:6，第一外引物SEQIDNO:5和第二外引物本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種單管巢式PCR反應體系，其特征在于：反應體系中包括雙鏈DNA模板、外引物對和內引物對，所述外引物從5’端到3’端包括互補序列和靶區結合序列，所述靶區結合序列遠離互補序列的末端與所述互補序列的堿基互補，所述外引物用于在第一退火溫度下對變性解鏈的DNA模板擴增并獲得中間產物，所述內引物用于在第二退火溫度下對變性解鏈的中間產物擴增并獲得目標產物，所述外引物在第二退火溫度下形成引物雙鏈結構。

【技術特征摘要】
1.一種單管巢式PCR反應體系，其特征在于：反應體系中包括雙鏈DNA模板、外引物對和內引物對，所述外引物從5’端到3’端包括互補序列和靶區結合序列，所述靶區結合序列遠離互補序列的末端與所述互補序列的堿基互補，所述外引物用于在第一退火溫度下對變性解鏈的DNA模板擴增并獲得中間產物，所述內引物用于在第二退火溫度下對變性解鏈的中間產物擴增并獲得目標產物，所述外引物在第二退火溫度下形成引物雙鏈結構。2.根據權利要求1所述的單管巢式PCR反應體系，其特征在于：所述引物雙鏈結構包括引物發卡結構或引物二聚體結構。3.根據權利要求2所述的單管巢式PCR反應體系，其特征在于：所述外引物對包括第一外引物和第二外引物，所述引物雙鏈結構為第一外引物和第二外引物之間形成的雙鏈結構。4.根據權利要求2所述的單管巢式PCR反應體系，其特征在于：所述外引物對包括第一外引物和第二外引物，所述引物發卡結構包括第一外引物或第二外引物自身形成的雙鏈結構。5.根據權利要求1所述的單管巢式PCR反應體系，其特征在于：所述第一退火溫度的范圍是65-72℃，所述第二退火溫度的范圍是50-62℃。6.根...

【專利技術屬性】
技術研發人員：盛司潼，黃思強，
申請(專利權)人：廣州康昕瑞基因健康科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44