基于POCT模式的IL28B基因型快速檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術提供一種基于POCT模式的IL28B基因型快速檢測試劑盒，所述試劑盒含有用于檢測IL28B基因型的熒光定量PCR引物和探針以及細胞裂解液，所述PCR引物的序列如SEQ?ID?NO.1?2和SEQ?ID?NO.5?6所示，所述探針的序列如SEQ?ID?NO.3?4和SEQ?ID?NO.7?8所示。本試劑盒可實現即時檢測，無需DNA提純，可將樣本直接加入試劑中進行PCR反應，特別適合DNA含量較低樣本(如口腔脫落細胞)的快速、準確檢測，檢測準確率達99％以上，檢測靈敏度高，可以準確檢測低至0.125ng基因組DNA；整個檢測耗時短，1小時內可得檢測結果，能在第一時間給醫生提供用藥依據，降低患者用藥風險。

Rapid Detection Kit for IL28B Genotype Based on POCT Model

The present invention provides a rapid detection kit for IL28B genotype based on POCT mode. The kit contains fluorescent quantitative PCR primers and probes for detecting IL28B genotype and cell lysate. The sequence of the PCR primers is shown as SEQ ID NO.1_2 and SEQ ID NO.5_6, and the sequence of the probes is shown as SEQ ID NO.3_4 and SEQ ID NO.7_8. This kit can be used for real-time detection without DNA purification. It can directly add samples to the reagent for PCR reaction. It is especially suitable for rapid and accurate detection of samples with low DNA content (such as oral exfoliated cells). The detection accuracy is over 99%, and the detection sensitivity is high. It can accurately detect genomic DNA as low as 0.125 ng. The whole detection time is short, and the detection results can be obtained within one hour. The first time to provide the basis for doctors to use drugs, reduce the risk of patients using drugs.

【技術實現步驟摘要】
基于POCT模式的IL28B基因型快速檢測試劑盒
本專利技術涉及分子生物學領域，具體地說，涉及一種基于POCT模式的IL28B基因型快速檢測試劑盒。
技術介紹
IL28B是第三類干擾素(interferon,IFN)家族的成員，主要由巨噬細胞和樹突細胞在接受病毒蛋白或Toll樣受體(toll-likereceptor)刺激時產生，負責肝臟和上皮組織的病毒免疫應答反應。IL28B具有多個單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)位點，包括rs8099917(T>G)、rs12980275(A>G)、rs12979860(C>T)等。其中，以rs12979860和rs8099917最為突出。1000genomeprojectphase3提供的數據表明，IL28B(rs12979860，C>T)等位基因在中國西雙版納傣族人群中等位基因C出現的頻率占89.78％；在中國北京漢族人群中IL28B(rs12979860，C>T)等位基因C出現的頻率占93.69％；在中國南方漢族人群中IL28B(rs12979860，C>T)等位基因C出現的頻率占95.24％；IL28B(rs8099917，T>G)等位基因在中國西雙版納傣族人群中等位基因T出現的頻率占90.32％；在中國北京漢族人群中IL28B(rs8099917，T>G)等位基因T出現的頻率占93.69％；在中國南方漢族人群中IL28BIL28B(rs8099917，T>G)等位基因T出現的頻率占94.76％。研究表明，IL28B基因位點的突變影響轉錄因子結合，使得IL28B本身，甚至該基因上游約3kb的同家族基因IL28A和IL29的轉錄降低，不利于病毒在患者體內的清除，影響抗病毒治療的效果。以1型丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)的抗病毒治療為例。聚乙二醇(PEG)干擾素α(PEG-IFNα)聯合應用利巴韋林作為1型HCV的主要治療方案，通過抑制核酸的復制和表達，可以起到較好的抗病毒效果。文獻報道，IL28B基因的兩個SNP，即rs12979860(C>T)和rs8099917(T>G)，影響聚乙二醇(PEG)干擾素α(PEG-IFNα)聯合應用利巴韋林的抗病毒治療效果。IL28B基因(rs12979860)CC野生型或IL28B基因(rs8099917)TT野生型的患者與IL28B基因(rs12979860)CT/TT或IL28B基因(rs8099917)TG/GG雜合型和突變型的患者相比，獲得了更高的持續病毒應答反應。因此，應針對不同的IL28B基因型患者給予最合理的藥物用量，可有效提高HCV的抗病毒治療效果。目前，國內丙型肝炎病毒感染者人數已超過4000萬，于是，快速、精確地診斷IL28B基因型，成為了人們迫切的需求。目前，檢測IL28B的方法主要有測序法、基因芯片法和熒光定量PCR法。測序法和基因芯片法對檢測結果具有很高的精度，其依賴大型精密儀器設備、固定實驗室以及專業操作人員，因此，這兩種檢測方法成本高，步驟繁瑣并且耗時長，在臨床上很難進行推廣。公開的專利(專利號CN104774918A)使用了基于Taqman探針的熒光PCR方法。雖然該方法具有成本低，時間短和結果分析簡單的優點，但是由于該反應體系只能擴增純化后的基因組DNA樣本，所以必須采用多步驟多管操作，在臨床推廣上也不理想。因此這些常規的檢測技術都難以滿足國內攜帶IL28B突變基因的人群對IL28B基因檢測快速、準確的要求。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一套用于檢測IL28B基因型的熒光定量PCR引物組合和探針組合。本專利技術的另一目的是提供一種基于POCT模式的IL28B基因型快速檢測試劑盒。為了實現本專利技術目的，本專利技術提供一套用于檢測IL28B基因型的熒光定量PCR引物組合和探針組合，包括上游引物、下游引物、野生型探針和突變型探針。檢測IL28B基因的引物組合包括：檢測IL28B(rs12979860)位點的引物：上游引物：5’-GATGGGTACTGGCAGCGC-3’；下游引物：5’-GGAGCGCGGAGTGCAATTC-3’；檢測IL28B(rs8099917)位點的引物：上游引物：5’-GTAAGTCTTGTATTTCACCTCCTGG-3’；下游引物：5’-AAAAGCCAGCTACCAAACTGTAT-3’。所述探針組合中的探針如SEQIDNO.3-4和SEQIDNO.7-8所示。作為優選，所述探針組合包括：檢測IL28B(rs12979860)位點的探針：野生型探針：5’-AAGGCGCGAACC-3’；突變型探針：5’-CGAAGGCG+TGAACCA-3’；檢測IL28B(rs8099917)位點的探針：野生型探針：5’-TGAGCAAT+TTCACCCA-3’；突變型探針：5’-TGAGCAAT+GTCACCCA-3’；其中，“+”表示右側的單堿基為LNA修飾。所述探針需在5’端連接報告熒光基團，在3’端連接熒光淬滅基團。所述報告熒光基團與淬滅基團可選用本領域常用的報告熒光基團與淬滅基團。在本專利技術的具體實施方式中，所述探針采用的報告熒光基團為FAM或TexasRed，淬滅熒光基團為MGB。本專利技術還提供含有所述引物和探針的檢測試劑或試劑盒。本專利技術還提供一種基于POCT模式的IL28B基因型快速檢測試劑盒，所述試劑盒至少含有所述引物和探針以及細胞裂解液；其中，所述細胞裂解液由十二烷基硫酸鈉和聚乙二醇辛基苯基醚組成。具體地以十二烷基硫酸鈉0.0005-0.015％w/v和聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03％w/v作為200×細胞裂解液母液。使用時，按比例稀釋。優選地，所述細胞裂解液(200×母液)為：十二烷基硫酸鈉0.009％w/v，聚乙二醇辛基苯基醚0.01％w/v；或十二烷基硫酸鈉0.005％w/v，聚乙二醇辛基苯基醚0.02％w/v；或十二烷基硫酸鈉0.005％w/v，聚乙二醇辛基苯基醚0.001％w/v；或十二烷基硫酸鈉0.015％w/v，聚乙二醇辛基苯基醚0.003％w/v。本專利技術所述試劑盒中還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液、標準陽性模板、采樣棒(例如，一次性口腔拭子)、樣品收集管等中的至少一種。優選地，所述TaqDNA聚合酶為熱啟動TaqDNA聚合酶。本領域技術人員應當理解，為了取得最佳的檢測效果，在進行PCR反應檢測時，應當針對不同的檢測對象(不同位點)在獨立的反應體系中分別進行檢測。與本專利技術所述試劑盒配套的PCR反應體系中各組分的終濃度為：0.5-1.5×PCR反應緩沖液、TaqDNA聚合酶0.04-0.1U/μL、dNTPs0.1-0.5mM、上游引物0.2-0.7μM、下游引物0.2-0.7μM、野生型探針0.2-0.7μM、突變型探針0.2-0.7μM、Mg2+1-2.5mM和1×細胞裂解液。優選地，所述PCR反應體系中各組分的終濃度為：1.1×PCR反應緩沖液、TaqDNA聚合酶0.05-0.本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種檢測IL28B基因多態性的引物組合，其特征在于，檢測IL28B基因的引物組合包括：檢測IL28B(rs12979860)位點的引物：上游引物：5’?GATGGGTACTGGCAGCGC?3’；下游引物：5’?GGAGCGCGGAGTGCAATTC?3’；檢測IL28B(rs8099917)位點的引物：上游引物：5’?GTAAGTCTTGTATTTCACCTCCTGG?3’；下游引物：5’?AAAAGCCAGCTACCAAACTGTAT?3’。

【技術特征摘要】
1.一種檢測IL28B基因多態性的引物組合，其特征在于，檢測IL28B基因的引物組合包括：檢測IL28B(rs12979860)位點的引物：上游引物：5’-GATGGGTACTGGCAGCGC-3’；下游引物：5’-GGAGCGCGGAGTGCAATTC-3’；檢測IL28B(rs8099917)位點的引物：上游引物：5’-GTAAGTCTTGTATTTCACCTCCTGG-3’；下游引物：5’-AAAAGCCAGCTACCAAACTGTAT-3’。2.與權利要求1所述引物組合配套使用的探針組合，其特征在于，所述探針組合包括如SEQIDNO.3-4和SEQIDNO.7-8所示的探針。3.根據權利要求2所述的探針組合，其特征在于，所述探針組合包括：檢測IL28B(rs12979860)位點的探針：野生型探針：5’-AAGGCGCGAACC-3’；突變型探針：5’-CGAAGGCG+TGAACCA-3’；檢測IL28B(rs8099917)位點的探針：野生型探針：5’-TGAGCAAT+TTCACCCA-3’；突變型探針：5’-TGAGCAAT+GTCACCCA-3’；其中，“+”表示右側的單堿基為LNA修飾。4.含有權利要求1所述引物組合和權利要求2或3所述探針組合的檢測試劑或試劑盒。5.一種檢測IL28B基因多態性的PCR反應液，其特征在于，所述PCR反應液包括權利要求1所述的引物組合與權利要求2或3所述的探針組合...

【專利技術屬性】
技術研發人員：賀庭禎，羅德朋，向霄，熊偉，黎幫勇，鐘越，劉黎，董銳，崔奇新，楊園，
申請(專利權)人：重慶京因生物科技有限責任公司，
類型：發明
國別省市：重慶,50