一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法及組合物及在治愈表達(dá)特異性抗原的腫瘤中的應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物細(xì)胞領(lǐng)域，涉及一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法及應(yīng)用，本發(fā)明專利技術(shù)采取人源或鼠源的CD4+未分化T細(xì)胞，采用T細(xì)胞激活和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β,白細(xì)胞介素?4,白細(xì)胞介素?21和γ?干擾素中和抗體一系列細(xì)胞因子共同刺激。以此方法極化的T細(xì)胞，在大量增殖的情況下，如14日內(nèi)500?1000倍，同時(shí)保有針對(duì)癌細(xì)胞的殺傷性和自我分化增殖能力。其性狀不同于之前報(bào)導(dǎo)過(guò)，用于對(duì)抗癌癥的Th1,Th17和Th9等亞群，并且在殺傷癌癥功效上有所超過(guò)。以這種方法極化的CD4+T細(xì)胞亞群,其對(duì)多種表達(dá)特異性抗原的癌癥，包括固體和血液腫瘤有強(qiáng)大治療作用。

A Polarization and Expansion Method and Composition of CD4+T Cells and Its Application in Curing Tumors Expressing Specific Antigens

The invention belongs to the field of biological cells, and relates to a method for polarizing and amplifying CD4+T cells and its application. The invention adopts human or mouse CD4+undifferentiated T cells, and uses T cells to activate and transform growth factor beta, interleukin 4, interleukin 21 and interferon gamma neutralizing antibody to stimulate a series of cytokines together. T cells polarized by this method can proliferate in large quantities, such as 500 to 1000 times within 14 days, while maintaining the killing and self-differentiation ability against cancer cells. It is different from Th1, Th17 and Th9, which have been reported before, and is more effective in killing cancer than Th1, Th17 and Th9. CD4 + T cell subsets polarized in this way have a powerful therapeutic effect on a variety of cancers expressing specific antigens, including solid and blood tumors.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法及組合物及在治愈表達(dá)特異性抗原的腫瘤中的應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于生物細(xì)胞領(lǐng)域，尤其涉及一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法及組合物及在治愈表達(dá)特異性抗原的腫瘤中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
免疫細(xì)胞回輸是近年專利技術(shù)的癌癥治療方法，其基本原理是：回輸?shù)募?xì)胞會(huì)對(duì)宿主的癌癥細(xì)胞和癌癥組織產(chǎn)生特異性的攻擊性，或刺激宿主體內(nèi)的其他免疫細(xì)胞，使其攻擊癌癥。研究者采用過(guò)多種細(xì)胞進(jìn)行回輸，包括T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞(Macrophage)，自然殺傷細(xì)胞(NK)和自然殺傷T細(xì)胞(NKT)等。同時(shí)，很多實(shí)驗(yàn)采用了：以上列舉細(xì)胞的加工和修飾(如嵌合抗原受體T細(xì)胞療法，CAR-T)，或多種細(xì)胞聯(lián)合使用，或采用細(xì)胞和其他藥品/細(xì)胞素/疫苗的組合(比如注入T細(xì)胞后，持續(xù)注入IL-2)。T淋巴細(xì)胞的作用是主導(dǎo)的和不可或缺的，其他幾種細(xì)胞獨(dú)自使用幾乎沒(méi)有治療效果。T細(xì)胞回輸療法，對(duì)血液腫瘤和固體腫瘤都產(chǎn)生了不同程度的治療效果。CAR-T療法，在治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(BcellALL)上，取得了突破性的療效。Novartis和KitePharma的治療方案Kymriah和Yescarta，前者在BcellALL的化療失敗的病人身上取得了83％的癌癥緩解率，后者在BcellALL和B細(xì)胞淋巴癌(DLBCL)化療失敗病人上，有51％的緩解率。但是這些療法的缺陷之一是復(fù)發(fā)率較高。而且一旦復(fù)發(fā)，就不再有有效治療手段。相對(duì)其它效果來(lái)說(shuō)，T細(xì)胞回輸療法，對(duì)固體瘤療效欠佳。科學(xué)家和醫(yī)生嘗試采過(guò)用癌癥侵入T細(xì)胞，DC激活的外周血T細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞等，對(duì)化療失敗的黑色素瘤，腸癌，食道癌，肺癌，腦膠質(zhì)瘤等多種固體腫瘤治療，但是至今極少有臨床實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)率超過(guò)50％。多數(shù)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)率僅在10％-20％。T細(xì)胞療法療法的功效和至少三個(gè)指標(biāo)相關(guān)，一是T細(xì)胞對(duì)癌癥的殺傷性，二是T細(xì)胞針對(duì)癌癥的導(dǎo)向性，三是T細(xì)胞自身的存活。而且療法如需成功，必須要專一性強(qiáng)，副作用小。其中導(dǎo)向性，使用CAR-T和癌癥侵入T細(xì)胞則可以解決。T細(xì)胞的殺傷性和存活性，是目前急需增強(qiáng)的性質(zhì)。如目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用的細(xì)胞毒性CD8T細(xì)胞，在回輸病人體內(nèi)后，一個(gè)月內(nèi)就會(huì)損失穿過(guò)99％。再如，數(shù)次CAR-T的臨床試驗(yàn)中，有病人死于副作用-細(xì)胞素風(fēng)暴。T細(xì)胞有很多亞群，比較為人熟知的有CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞等等。其中每種又有更加細(xì)化的亞群劃分，如CD4+T細(xì)胞，被研究者明確報(bào)導(dǎo)過(guò)的亞群分為Th1(HelperTCellType1)，Th2，Th9，Th17，Tfh(FollicleBhelperTcell)和Treg(RegulatoryTcell)。目前，大部分研究者在臨床實(shí)驗(yàn)T細(xì)胞回輸技術(shù)時(shí)，只關(guān)注采用了CD4+或CD8+的使用，而忽略了更加細(xì)分的亞群。如多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)，采用的是純化的CD8+T細(xì)胞，一小部分實(shí)驗(yàn)，采用了CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞按照1：1比例注射。另一小部分實(shí)驗(yàn)，采用了全CD4+T細(xì)胞。但是幾乎沒(méi)有臨床實(shí)驗(yàn)深入關(guān)注CD8+和/或CD4+T細(xì)胞的具體構(gòu)成。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)提供一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法及組合物及在治愈表達(dá)特異性抗原的腫瘤中的應(yīng)用，能夠誘導(dǎo)出一種新型T細(xì)胞亞群；誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)單，易操作，產(chǎn)生的亞群在基因表達(dá)和性狀上，也明顯區(qū)別于現(xiàn)有的T細(xì)胞，誘導(dǎo)出的新型T淋巴細(xì)胞對(duì)呈遞特異性抗原的固體和血液腫瘤有強(qiáng)大的殺傷力和清除性，同時(shí)擁有長(zhǎng)期存活，抵抗疲勞，不會(huì)分化為調(diào)控性T細(xì)胞，不會(huì)引起細(xì)胞因子風(fēng)暴(副作用低)和癌癥組織導(dǎo)向性等。這種新型T細(xì)胞亞群具有干細(xì)胞和強(qiáng)力的體內(nèi)生存能力。本專利技術(shù)提供解決以上技術(shù)問(wèn)題的一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法：包括以下步驟：(1)獲取純化的CD4+T細(xì)胞：分離純化或誘導(dǎo)培育后的CD4+T細(xì)胞、CD4+或CD62L+T細(xì)胞；(2)激活細(xì)胞：在特殊培養(yǎng)基中0-24小時(shí)內(nèi)激活步驟(1)中獲得的細(xì)胞；激活方法為Dynabeads,antiCD3抗體加antiCD28抗體，通過(guò)DC細(xì)胞呈遞特異性多肽,ConcanavalinA試劑或BrefeldinACocktail(phorbol12-myristate-13-acetate,ionomycin,加BrefeldinA)試劑或類似試劑。(3)培養(yǎng)及細(xì)胞增殖：在激活后的第三天，將細(xì)胞離心，去上清，并培養(yǎng)于輔以10％胎牛血清，抗生素(Antibiotic-Antimycotic(1X)-ThermoFisherScientific)和100U/mL白細(xì)胞介素-2的RPMI-1640(后簡(jiǎn)稱為RPMI)培養(yǎng)基中；刺激增值和誘導(dǎo)分化；被激活后的T細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)快速的增殖，細(xì)胞數(shù)加倍時(shí)間小于24小時(shí)。整體擴(kuò)增時(shí)間大約會(huì)持續(xù)14天。細(xì)胞加倍時(shí)間，是衡量細(xì)胞增值速度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。時(shí)間越短，細(xì)胞增殖越快。本專利技術(shù)中細(xì)胞每天以2-10倍的速度增殖，增殖持續(xù)≥14天。保護(hù)極化增殖刺激至少7天，至多14天后的細(xì)胞特性。(4)取激活末期的細(xì)胞并檢測(cè)，即可。處于激活末期的T細(xì)胞即為成品，應(yīng)對(duì)其功效進(jìn)行檢測(cè)，包括體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。所述步驟(1)中的細(xì)胞來(lái)源包括并不限于人源的外周血，臍帶血，免疫器官內(nèi)的血細(xì)胞和血前體細(xì)胞，癌癥侵入淋巴細(xì)胞(包括原位腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤)和鼠源的外周血和免疫器官內(nèi)的血細(xì)胞，比如從脾臟或淋巴結(jié)獲取。初始的CD4+T細(xì)胞包括所有表達(dá)CD4表面抗原的T細(xì)胞。包括但不限于，人外周血，臍帶血，癌癥侵入細(xì)胞，以及其他事先操作過(guò)的CD4+T細(xì)胞。可先從骨髓，臍帶血等來(lái)源取得造血干細(xì)胞，淋巴母細(xì)胞等T細(xì)胞前體，并誘導(dǎo)分化至CD4+T細(xì)胞。所述步驟(2)中激活細(xì)胞的培養(yǎng)基為RPMI輔以10％胎牛血清的培養(yǎng)基中加入100ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β,100ng/mL白細(xì)胞介素-4,100ng/mL白細(xì)胞介素-21、100ng/mL的γ-干擾素中和抗體,或相同試劑，不同濃度；所述步驟(3)中培養(yǎng)基為RPMI輔以10％胎牛血清+抗生素和100u/ml白細(xì)胞介素-2。這樣誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞，輸回病人體內(nèi)，對(duì)癌癥有殺傷力。所述步驟(2)中采用免疫磁珠(Dynabeads)激活T細(xì)胞，免疫磁珠和細(xì)胞比例為1:1，或相似比例。所述步驟(3)前還有對(duì)CD4+T細(xì)胞進(jìn)行修飾步驟；如對(duì)T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)嵌合抗原受體或其他細(xì)胞因子。優(yōu)化方案中所述修飾步驟可以在CD4+T細(xì)胞被激活后4小時(shí)-96小時(shí)完成；更進(jìn)一步優(yōu)化方案中所述修飾步驟在CD4+T細(xì)胞被激活后24小時(shí)內(nèi)完成。所述修飾步驟為對(duì)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)一段由DNA或RNA為載體的編碼基因；優(yōu)化方案中所述轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的編碼基因，包擴(kuò)但不限于嵌合式抗原受體，T細(xì)胞受體序列或其他細(xì)胞素或細(xì)胞表面受體；所述轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法包括但不限于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒或轉(zhuǎn)座子。所述轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法依次包括按照序列生產(chǎn)DNA質(zhì)粒步驟、采用這些質(zhì)粒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裹步驟、取得宿主T細(xì)胞并進(jìn)行激活和極化步驟、在極化24小時(shí)后采用病毒對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟，以及用上述方法繼續(xù)擴(kuò)增T細(xì)胞，直到達(dá)到所需的T細(xì)胞數(shù)目，或T細(xì)胞停止擴(kuò)增。應(yīng)用時(shí)可將細(xì)胞通過(guò)靜脈回輸進(jìn)宿主體內(nèi)；選擇同時(shí)輔助以其他癌癥療法，包括但不限于細(xì)胞因子注射；即選擇細(xì)胞素注射作為療法的一部份，本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法：包括以下步驟：獲取純化的CD4+T細(xì)胞：分離純化或誘導(dǎo)培育后的CD4+T細(xì)胞、CD4+或CD62L+?T細(xì)胞；（2）激活細(xì)胞：在培養(yǎng)基中0?24小時(shí)內(nèi)激活步驟（1）中獲得的細(xì)胞；（3）培養(yǎng)及細(xì)胞增殖：在激活后的第三天，將細(xì)胞離心，去上清，并培養(yǎng)于輔以10%胎牛血清，抗生素和100U/mL?白細(xì)胞介素?2的培養(yǎng)基中；刺激增值和誘導(dǎo)分化；（4）取激活末期的細(xì)胞并檢測(cè)，即可。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法：包括以下步驟：獲取純化的CD4+T細(xì)胞：分離純化或誘導(dǎo)培育后的CD4+T細(xì)胞、CD4+或CD62L+T細(xì)胞；（2）激活細(xì)胞：在培養(yǎng)基中0-24小時(shí)內(nèi)激活步驟（1）中獲得的細(xì)胞；（3）培養(yǎng)及細(xì)胞增殖：在激活后的第三天，將細(xì)胞離心，去上清，并培養(yǎng)于輔以10%胎牛血清，抗生素和100U/mL白細(xì)胞介素-2的培養(yǎng)基中；刺激增值和誘導(dǎo)分化；（4）取激活末期的細(xì)胞并檢測(cè)，即可。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟（1）中的細(xì)胞來(lái)源包括并不限于人源的外周血，臍帶血，免疫器官內(nèi)的血細(xì)胞和血前體細(xì)胞，癌癥侵入淋巴細(xì)胞和鼠源的外周血和免疫器官內(nèi)的血細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟（2）中激活細(xì)胞的培養(yǎng)基為RPMI-1640輔以10%胎牛血清的培養(yǎng)基中加入100ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β,100ng/mL白細(xì)胞介素-4,100ng/mL白細(xì)胞介素-21、100ng/mL的γ-干擾素中和抗體,或相同試劑，不同濃度；所述步驟（3）中培養(yǎng)基為RPMI-1640輔以10%胎牛血清+抗生素和100u/ml白細(xì)胞介素-2。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟（2）中采用免疫磁珠激活T細(xì)胞，免疫磁珠和細(xì)胞比例為1:1，或相似比例。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟（3）前還有對(duì)CD4+T細(xì)胞進(jìn)行修飾步驟；優(yōu)化方案中所述修飾步驟可以在CD4+T細(xì)胞被激活后4-96小時(shí)完成；更進(jìn)一步優(yōu)化方案中所述修飾步驟在CD4+T細(xì)胞被激活后24小時(shí)內(nèi)完成。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種極化和擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞的方法，其特征在于：所述修飾步驟為對(duì)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)一段由...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：魯勇，田野，孫濤，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：魯勇，田野，孫濤，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海,31