一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種25?羥基維生素D3的抗體制備方法，包括人工抗原制備、動物免疫及脾細(xì)胞制備、骨髓瘤細(xì)胞的制備、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選和亞克隆、25?羥基維生素D3單克隆抗體純化等步驟，由于25?羥基維生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，本發(fā)明專利技術(shù)將25?羥基維生素D3偶聯(lián)卵清白蛋白獲得25?羥基維生素D3人工抗原，所制備的25?羥基維生素D3單克隆抗體具有效價高、親和力好，與25?羥基維生素D3抗原結(jié)合力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于免疫熒光、酶聯(lián)免疫或磁微粒免疫技術(shù)等來定性或定量檢測人體中25?羥基維生素D3表達(dá)水平，臨床輔助預(yù)防及治療佝僂病、骨軟化病和嬰兒手足搐搦癥。

A preparation method of 25-hydroxyvitamin D3 antibody

The present invention discloses a preparation method of 25 hydroxyvitamin D3 antibody, including artificial antigen preparation, animal immunity and spleen cell preparation, myeloma cell preparation, feeder cell preparation, cell fusion, hybridoma cell screening and subcloning, 25 hydroxyvitamin D3 monoclonal antibody purification and other steps. Because the molecular weight of 25 hydroxyvitamin D3 itself is too small, there is no such step. The present invention has immunogenicity. The 25 hydroxyvitamin D3 conjugated ovalbumin obtains 25 hydroxyvitamin D3 artificial antigen. The prepared 25 hydroxyvitamin D3 monoclonal antibody has the advantages of high potency, good affinity and strong binding with 25 hydroxyvitamin D3 antigen. It can be used for qualitative or quantitative detection of human body by immunofluorescence, enzyme-linked immunosorbent assay or magnetic particle immunoassay. 25. Level of hydroxyvitamin D3 expression, clinical adjuvant prevention and treatment of rickets, osteomalacia and infantile tetany.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法
本專利技術(shù)涉及細(xì)胞工程
，具體涉及一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法。
技術(shù)介紹
血清25羥基維生素D3是合成25-OH-VD3的前體，是維生素D的主要循環(huán)形式，其半壽期較長,血中濃度較穩(wěn)定，可直接反映機(jī)體維生素D的水平，維生素D參與不但鈣磷代謝的調(diào)節(jié)作用，近年來維生素D被證實具有更為廣泛的生物學(xué)效應(yīng)和免疫學(xué)效應(yīng)，包括用以預(yù)防及治療佝僂病、骨軟化病和嬰兒手足搐搦癥，抑制多種類型細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡和分化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能等。因此，血清中的25羥維生素D3已經(jīng)成為健康體檢的重要指標(biāo)。現(xiàn)在有越來越多公司參與開發(fā)25羥維生素D3檢測試劑盒，高品質(zhì)的抗體，是開發(fā)25羥維生素D3檢測試劑盒的關(guān)鍵技術(shù)和基礎(chǔ)，但是當(dāng)前的25羥維生素D3檢測試劑盒，無論使用哪種技術(shù)，放射免疫法，膠體金，酶聯(lián)免疫法，化學(xué)發(fā)光檢測，磁微粒免疫技術(shù)，都不能得到與HPLC精確測試相媲美的結(jié)果，因此需進(jìn)一步研發(fā)出一種25-羥基維生素D3單克隆抗體，可用于能夠快速、準(zhǔn)確檢測25-羥基維生素D3的免疫檢測試劑盒。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，制備的抗體特異性好，親和力高，能夠用于25-羥基維生素D3免疫熒光檢測試劑盒，對人體內(nèi)25-羥基維生素D3蛋白做出準(zhǔn)確的檢測。為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供如下技術(shù)方案：一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，包括如下步驟：(1)25-羥基維生素D3人工抗原制備：將25-羥基維生素D3蛋白與N,N二甲基酰胺混合均勻后，加入三乙胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，加入氯甲酸異丁酯，混勻4℃反應(yīng)，得到活化的25-羥基維生素D3蛋白；將OVA(卵清白蛋白)溶于超純水中，通過氫氧化鈉調(diào)整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，得到活化的卵清白蛋白；將活化的25-羥基維生素D3蛋白與活化的卵清白蛋白混合4℃反應(yīng)，反應(yīng)完成后先用PBS緩沖液透析，重復(fù)2次，再用超純水透析，重復(fù)2次，即得25-羥基維生素D3人工抗原；(2)動物免疫及脾細(xì)胞制備：采用BALB/c小鼠，將25-羥基維生素D3人工抗原與弗氏完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周，將25-羥基維生素D3人工抗原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周進(jìn)行抗原沖擊，25-羥基維生素D3人工抗原尾靜脈注射，3天后，取效價高小鼠的免疫脾細(xì)胞，將免疫脾細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中；(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備：骨髓瘤細(xì)胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，融合前1天，進(jìn)行細(xì)胞換液并使細(xì)胞在融合當(dāng)天為對數(shù)生長階段；(4)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：細(xì)胞融合前4天，處死未免疫的8周齡KM雌性小鼠，消毒后在無菌的條件下，取小鼠腹腔細(xì)胞，即飼養(yǎng)細(xì)胞，用HAT培養(yǎng)基將沉淀飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮，將上述飼養(yǎng)細(xì)胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用；(5)細(xì)胞融合：將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，放入融合管中，離心機(jī)離心，棄上清；將1mL50％PEG4000沿轉(zhuǎn)動的管壁滴入，60s內(nèi)加完，在5min內(nèi)加入25mLDMEM培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，離心機(jī)離心，棄上清，加入HAT培養(yǎng)基，輕輕吹打使沉淀細(xì)胞懸浮；將細(xì)胞懸液加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合后第7天每孔用HAT完全培養(yǎng)液半換液，融合后第14天用HT完全培養(yǎng)基半換液，融合后第21天用RPMI-1640完全培養(yǎng)液換液；(6)細(xì)胞篩選：融合細(xì)胞長至孔底1/10面積時，用碳酸鹽緩沖液將25-羥基維生素D3人工抗原稀釋為5ug/ml，加入酶標(biāo)板孔中，4℃過夜，棄去孔內(nèi)液體，磷酸鹽緩沖液清洗2次，每孔加封閉液4℃過夜，封閉液為含2％BSA的磷酸鹽緩沖液，經(jīng)洗滌液洗滌后，洗滌液為0.1％Tween20的磷酸鹽緩沖液，加入待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，孵育，經(jīng)洗滌液洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，孵育，再經(jīng)洗滌液洗滌后，加入含3％H2O2的鄰苯二胺底物液顯色，以H2SO4終止反應(yīng)，讀取OD值，選擇OD值比陰性對照高5-10倍的雜交瘤細(xì)胞再克隆化，并進(jìn)行擴(kuò)增凍存；(7)亞克隆-軟瓊脂法：在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞，將瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1％瓊脂糖培養(yǎng)液，45℃水浴中溫育，吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1％瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘，取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml，加入1％瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層，37℃、7.5％濕潤培養(yǎng)10天；克隆生長至2mm時，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)，吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，直至到100％細(xì)胞陽性率，最終得到高特異性25-羥基維生素D3雜交瘤細(xì)胞株，將高特異性25-羥基維生素D3雜交瘤細(xì)胞株液氮保存；(8)抗體純化：將上述高特異性25-羥基維生素D3雜交瘤細(xì)胞株于無血清培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞濃度達(dá)105/ml以上時停止加液，再持續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞培養(yǎng)液變黃后收集培養(yǎng)液，離心機(jī)離心，上清液再經(jīng)濾膜過濾后，將上清液置于protein-A親合層析柱中，protein-A親合層析柱以磷酸鹽緩沖液洗滌去除雜蛋白，再以5倍柱體積的甘氨酸溶液洗脫被吸附的抗體蛋白，并加入Tris溶液中和甘氨酸，使pH為7.2，再以10倍柱體積的磷酸鹽緩沖液透析16小時后，其中換液2次，透析后的樣品再經(jīng)濾膜過濾后即獲得純化的25-羥基維生素D3單克隆抗體。本專利技術(shù)具有有益效果：由于25-羥基維生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，本專利技術(shù)將25-羥基維生素D3進(jìn)行化學(xué)修飾，偶聯(lián)卵清白蛋白獲得25-羥基維生素D3人工抗原；本專利技術(shù)所制備的25-羥基維生素D3單克隆抗體具有效價高、親和力好，與25-羥基維生素D3抗原結(jié)合力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于免疫熒光、酶聯(lián)免疫或磁微粒免疫技術(shù)等來定性或定量檢測人體中25-羥基維生素D3表達(dá)水平，臨床輔助預(yù)防及治療佝僂病、骨軟化病和嬰兒手足搐搦癥。具體實施方式下面將結(jié)合本專利技術(shù)實施例對本專利技術(shù)實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例1一種25-羥基維生素D3單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：(1)抗原制備：取100mg25-羥基維生素D3蛋白與1mlN,N二甲基酰胺混合均勻后，加入15ul三乙胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)2h，加入50ul氯甲酸異丁酯，混勻4℃反應(yīng)1h，得到活化的25-羥基維生素D3蛋白；稱取200mgOVA(卵清白蛋白)溶于2ml超純水中，調(diào)整pH至8.5，加入1mlN,N二甲基酰胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)2h，得到活化的卵清白蛋白；將活化的25-羥基維生素D3蛋白與活化的卵清白蛋白混合4℃反應(yīng)4h，反應(yīng)完成后先用PBS緩沖液(50mM，pH＝7.2)透析6h，重復(fù)2次，再用超純水透析10h，重復(fù)2次，即得25-羥基維生素D3人工抗原；由于25-羥基維生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，缺乏T細(xì)胞表位而無法直接誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，需要對25-羥基維生素D3進(jìn)行化學(xué)修飾，偶聯(lián)獲得能誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖和分化繼而產(chǎn)生特異性抗體的25-羥基維生素D3人工抗原；(2)動物免疫及脾細(xì)胞制備：采用BALB/c小鼠，將25-羥基維生素D3人工抗原與弗氏完全佐劑等體本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種25?羥基維生素D3的抗體制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)25?羥基維生素D3人工抗原制備：將25?羥基維生素D3蛋白與N,N二甲基酰胺混合均勻后，加入三乙胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，加入氯甲酸異丁酯，混勻4℃反應(yīng)，得到活化的25?羥基維生素D3蛋白；將OVA溶于超純水中，通過氫氧化鈉調(diào)整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，得到活化的卵清白蛋白；將活化的25?羥基維生素D3蛋白與活化的卵清白蛋白混合4℃反應(yīng)，反應(yīng)完成后先用PBS緩沖液透析，重復(fù)2次，再用超純水透析，重復(fù)2次，即得25?羥基維生素D3人工抗原；(2)動物免疫及脾細(xì)胞制備：采用BALB/c小鼠，將25?羥基維生素D3人工抗原與弗氏完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周，將25?羥基維生素D3人工抗原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周進(jìn)行抗原沖擊，25?羥基維生素D3人工抗原尾靜脈注射，3天后，取效價高小鼠的免疫脾細(xì)胞，將免疫脾細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中；(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備：骨髓瘤細(xì)胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，融合前1天，進(jìn)行細(xì)胞換液并使細(xì)胞在融合當(dāng)天為對數(shù)生長階段；(4)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：細(xì)胞融合前4天，處死未免疫的8周齡KM雌性小鼠，消毒后在無菌的條件下，取小鼠腹腔細(xì)胞，即飼養(yǎng)細(xì)胞，用HAT培養(yǎng)基將沉淀飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮，將上述飼養(yǎng)細(xì)胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用；(5)細(xì)胞融合：將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，放入融合管中，離心機(jī)離心，棄上清；將1mL?50％PEG4000沿轉(zhuǎn)動的管壁滴入，60s內(nèi)加完，在5min內(nèi)加入25mL?DMEM培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，離心機(jī)離心，棄上清，加入HAT培養(yǎng)基，輕輕吹打使沉淀細(xì)胞懸浮；將細(xì)胞懸液加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合后第7天每孔用HAT完全培養(yǎng)液半換液，融合后第14天用HT完全培養(yǎng)基半換液，融合后第21天用RPMI?1640完全培養(yǎng)液換液；(6)細(xì)胞篩選：融合細(xì)胞長至孔底1/10面積時，用碳酸鹽緩沖液將25?羥基維生素D3人工抗原稀釋為5ug/ml，加入酶標(biāo)板孔中，4℃過夜，棄去孔內(nèi)液體，磷酸鹽緩沖液清洗2次，每孔加封閉液4℃過夜，經(jīng)洗滌液洗滌后，加入待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，孵育，經(jīng)洗滌液洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，孵育，再經(jīng)洗滌液洗滌后，加入含3％H2O2的鄰苯二胺底物液顯色，以H2SO4終止反應(yīng)，讀取OD值，選擇OD值比陰性對照高5?10倍的雜交瘤細(xì)胞再克隆化，并進(jìn)行擴(kuò)增凍存；(7)亞克隆：采用軟瓊脂法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，克隆數(shù)次，直至到100％細(xì)胞陽性率，最終得到高特異性25?羥基維生素D3雜交瘤細(xì)胞株；(8)抗體純化：將上述高特異性25?羥基維生素D3雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞濃度達(dá)105/ml以上時停止加液，再持續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞培養(yǎng)液變黃后收集培養(yǎng)液，離心機(jī)離心，上清液經(jīng)濾膜過濾后，將過濾后的上清液置于protein?A親合層析柱中，用磷酸鹽緩沖液洗滌層析柱去除雜蛋白，再以5倍柱體積的甘氨酸溶液洗脫被吸附的抗體蛋白，并加入Tris溶液中和甘氨酸，使pH為7.2，再以10倍柱體積的磷酸鹽緩沖液透析16小時后，透析后的樣品再經(jīng)濾膜過濾后即獲得純化的25?羥基維生素D3單克隆抗體。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種25-羥基維生素D3的抗體制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)25-羥基維生素D3人工抗原制備：將25-羥基維生素D3蛋白與N,N二甲基酰胺混合均勻后，加入三乙胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，加入氯甲酸異丁酯，混勻4℃反應(yīng)，得到活化的25-羥基維生素D3蛋白；將OVA溶于超純水中，通過氫氧化鈉調(diào)整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均勻后，4℃反應(yīng)，得到活化的卵清白蛋白；將活化的25-羥基維生素D3蛋白與活化的卵清白蛋白混合4℃反應(yīng)，反應(yīng)完成后先用PBS緩沖液透析，重復(fù)2次，再用超純水透析，重復(fù)2次，即得25-羥基維生素D3人工抗原；(2)動物免疫及脾細(xì)胞制備：采用BALB/c小鼠，將25-羥基維生素D3人工抗原與弗氏完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周，將25-羥基維生素D3人工抗原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，皮下多點(diǎn)注射小鼠，間隔3周進(jìn)行抗原沖擊，25-羥基維生素D3人工抗原尾靜脈注射，3天后，取效價高小鼠的免疫脾細(xì)胞，將免疫脾細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中；(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備：骨髓瘤細(xì)胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，融合前1天，進(jìn)行細(xì)胞換液并使細(xì)胞在融合當(dāng)天為對數(shù)生長階段；(4)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：細(xì)胞融合前4天，處死未免疫的8周齡KM雌性小鼠，消毒后在無菌的條件下，取小鼠腹腔細(xì)胞，即飼養(yǎng)細(xì)胞，用HAT培養(yǎng)基將沉淀飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮，將上述飼養(yǎng)細(xì)胞懸液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用；(5)細(xì)胞融合：將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，放入融合管中，離心機(jī)離心，棄上清；將1mL50％PEG4000沿轉(zhuǎn)動的管壁滴入，60s內(nèi)加完，在5min內(nèi)加入25mLDMEM培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，離心機(jī)離心，棄上清，加入HAT培養(yǎng)基，輕輕吹打使沉淀細(xì)胞懸浮；將細(xì)胞懸液加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合后第7天每孔用HAT完全培養(yǎng)液半換液，融合后第14天用HT完全培養(yǎng)基半換液，融合后第21天用...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：唐靜，田青青，陳星星，周義正，
申請(專利權(quán))人：寧波奧丞生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江,33