人源化抗體制造技術

本發明專利技術涉及結合焦谷氨酸化淀粉樣蛋白β(AβN3pE)肽N?末端表位的人源化抗體以及涉及與淀粉樣蛋白肽的積累和沉積相關疾病和疾病狀況的預防性和治療性治療，所述疾病和疾病狀況如淀粉樣變性，與焦谷氨酸化淀粉樣蛋白肽相關的一組病癥和異常，如阿爾茨海默病、唐氏綜合征、大腦淀粉樣血管病以及其他相關方面。更具體地，其涉及使用人源化單克隆抗體結合血漿、腦和腦脊液中的焦谷氨酸化淀粉樣蛋白β肽以防止大腦內和外周各種組織中AβN3p的積累或逆轉其沉積，以及緩解淀粉樣變性。本發明專利技術進一步涉及利用本發明專利技術的人源化抗體診斷淀粉樣變性的診斷測定。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】人源化抗體專利
本專利技術涉及結合焦谷氨酸化(pyroglutamated)淀粉樣蛋白β(AβN3pE)肽N-末端處的表位的人源化抗體以及涉及疾病和疾病狀況的預防性和治療性治療，所述疾病和疾病狀況涉及淀粉樣蛋白肽的積累和沉積，如淀粉樣變性，與焦谷氨酸化淀粉樣蛋白肽相關的一組病癥和異常，如阿爾茨海默病、唐氏綜合征、大腦淀粉樣血管病以及其他相關方面。更具體地，其涉及使用人源化單克隆抗體結合血漿、腦和腦脊液中的焦谷氨酸化淀粉樣蛋白β肽以防止大腦內和外周各種組織中AβN3p的積累或逆轉其沉積，以及緩解淀粉樣變性。本專利技術進一步涉及利用本專利技術的人源化抗體診斷淀粉樣變性的診斷測定。
技術介紹
淀粉樣變性不是單一疾病實體而是一組不同的進行性疾病過程，其特征在于稱作淀粉樣蛋白的蠟狀、淀粉樣的蛋白的胞外組織沉積，所述淀粉樣蛋白在一個或多個器官或身體系統中積累。隨著淀粉樣蛋白沉積積累，它們開始干擾器官或身體系統的正常功能。有至少15種不同類型的淀粉樣變性。主要形式是沒有已知前提的原發性淀粉樣變性、一些其他疾病狀況之后的繼發性淀粉樣變性和遺傳性淀粉樣變性。繼發性淀粉樣變性在慢性感染或炎性疾病期間發生，如結核病、稱作家族性地中海熱的細菌感染、骨感染(骨髓炎)、類風濕性關節炎、小腸的炎癥(肉芽腫性回腸炎)、霍奇金病和麻風。淀粉樣蛋白沉積包括淀粉樣蛋白P(五角形)組分(AP)，涉及正常血清淀粉樣蛋白P(SAP)的糖蛋白，以及硫酸化糖胺聚糖(GAG)，結締組織的復雜碳水化合物。占淀粉樣物質約90％的淀粉樣蛋白纖維包含幾種不同類型的蛋白之一。這些蛋白能夠折疊為所謂的“β-折疊”纖維，具有剛果紅結合位點的獨特蛋白構型，導致淀粉樣蛋白的獨特染色特性。衰老的許多疾病是基于淀粉樣蛋白或與淀粉樣蛋白相關，并且部分特征在于有助于發病機理以及疾病發展的淀粉樣蛋白或淀粉樣物質胞外沉積的建立。這些疾病包括但不限于神經系統病癥如輕度認知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，例如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默型癡呆(FAD)如家族性英國型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)，唐氏綜合征中的神經變性，路易體癡呆，具有淀粉樣變性的遺傳學腦出血(荷蘭型)；關島帕金森-癡呆綜合征。基于淀粉樣蛋白或與淀粉樣蛋白相關的其他疾病是進行性核上性麻痹，多發性硬化；Creutzfeldt-Jacob病，帕金森病，HIV相關癡呆，ALS(肌萎縮性側索硬化癥)，成人發病型糖尿病；老年性心臟淀粉樣變性；內分泌腫瘤等，包括黃斑變性。雖然這些疾病的發病機理可能不同，但是它們的特征性沉積常包含許多共同的分子組分。在很大程度上，這可以歸因于促炎途徑的局部激活，從而導致激活的補體組分、急性期反應物、免疫調節劑和其他炎癥介質的同時沉積(McGeeretal.,TohokuJExpMed.174(3):269-277(1994))。最近，越來越多的證據證明N-末端修飾的Aβ肽變體參與阿爾茨海默病。針對性活組織檢查顯示Aβ1-40和Aβ1-42不僅存在于阿爾茨海默病患者的腦中，而且還存在于未受影響的對象的老年斑中。但是，N-末端截短和pyroGlu修飾的AβN3pE-40/AβN3pE-42幾乎僅根深蒂固在阿爾茨海默病患者的斑塊內，使得這種Aβ變體成為合格的診斷標記和藥物開發的潛在靶標。目前，幾個商業制造商提供ELISA試劑盒，其允許檢測低皮克(pg)范圍中的Aβ1-40/1-42和AβN3pE-40/AβN3pE-42。阿爾茨海默病(AD)患者腦的形態學特征在于存在神經原纖維纏結和新皮層腦結構中Aβ肽的沉積(Selkoe,D.J.&Schenk,D.Alzheimer'sdisease:molecularunderstandingpredictsamyloid-basedtherapeutics.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.43,545-584(2003))。β-和γ-分泌酶順序切割后，Aβ肽從淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)釋放。γ-分泌酶切割導致產生Aβ1-40和Aβ1-42肽，其不同之處在于它們的C-末端，并且表現出不同的聚集、纖維形成和神經毒性潛能(Shin,R.W.etal.Amyloidbeta-protein(Abeta)1-40butnotAbeta1-42contributestotheexperimentalformationofAlzheimerdiseaseamyloidfibrilsinratbrain.J.Neurosci.17,8187-8193(1997)；Iwatsubo,T.etal.VisualizationofAbeta42(43)andAbeta40insenileplaqueswithend-specificAbetamonoclonals:evidencethataninitiallydepositedspeciesisAbeta42(43).Neuron13,45-53(1994)；Iwatsubo,T.,Mann,D.M.,Odaka,A.,Suzuki,N.&Ihara,Y.Amyloidbetaprotein(Abeta)deposition:Abeta42(43)precedesAbeta40inDownsyndrome.Ann.Neurol.37,294-299(1995)；Hardy,J.A.&Higgins,G.A.Alzheimer'sdisease:theamyloidcascadehypothesis.Science256,184-185(1992)；Roβner,S.,Ueberham,U.,Schliebs,R.,Perez-Polo,J.R.&Bigl,V.Theregulationofamyloidprecursorproteinmetabolismbycholinergicmechanismsandneurotrophinreceptorsignaling.Prog.Neurobiol.56,541-569(1998))。彌漫性斑塊中沉積的大部分Aβ肽是N-末端截短或修飾的。Piccini和Saido的研究已顯示老年斑和血管沉積的核心結構由50％焦谷氨酸(pyroGlu)修飾的肽組成(Piccinietal.,JBiolChem.2005Oct7；280(40):34186-92；Saidoetal.,Neuron.1995Feb；14(2):457-66)。PyroGlu修飾的肽具有比其他Aβ種類更強的細胞毒性，并且對氨肽酶穩定(Russoetal.,JNeurochem.2002Sep；82(6):1480-9)。因此，pyroGluAβ種類具有較長半衰期，從而這些種類的積累以及神經毒性寡聚體和聚集體的形成是有益的(Saido,NeurobiolAging.1998Jan-Feb；19(1Suppl):S69-75)。由于谷氨酸環化至pyroGlu，帶電荷的氨基酸會丟失，這強烈降低肽的溶解度并導致聚集趨勢增加。體外研究已顯示例如Aβ3(pE)的初始寡聚化與未修飾的肽相比快很多(Schillingetal.,Biochemistr本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種人源化抗體或其功能變體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLX1SDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLX2YLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ?ID?NO:7)，其中X1選自Y和H；并且X2選自A、I和T；或者包含選自以下的氨基酸序列、基本上由選自以下的氨基酸序列組成或由選自以下的氨基酸序列組成DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSDGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHVPPTFGQGTKVEIK(SEQ?ID?NO:28)；以及DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYVVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ?ID?NO:36)，和/或其中所述抗體的重鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGX3TMNWVRQAPGQGLEWMGLINPX4NX5VTRYNQKFX6GRVTX7X8RDTSTTTVX9MELTSLTSEDTAX10YYCTREAKRE?WDETYWGQGTLVTVSS(SEQ?ID?NO:17)；其中X3選自Y和H；X4選自Y和S；X5選自G、T、A和E；X6選自K和Q；X7選自L和I；X8選自I和T；X9選自Y和H；并且X10選自V和T；或者包含選自以下的氨基酸序列、基本上由選自以下的氨基酸序列組成或由選自以下的氨基酸序列組成EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGLEWVSFISN?LAYSIYYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDYDNILDYVMDYWGQGTLVTVSS(SEQ?ID?NO:32)，以及QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFNNYWINWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGDTNYNGKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYIVYWGQGTLVTVSS(SEQ?ID?NO:40)。...

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2015.07.16 US 62/193,356;2015.08.25 US 62/209,6501.一種人源化抗體或其功能變體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLX1SDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLX2YLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQIDNO:7)，其中X1選自Y和H；并且X2選自A、I和T；或者包含選自以下的氨基酸序列、基本上由選自以下的氨基酸序列組成或由選自以下的氨基酸序列組成DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSDGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHVPPTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:28)；以及DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYVVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQIDNO:36)，和/或其中所述抗體的重鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGX3TMNWVRQAPGQGLEWMGLINPX4NX5VTRYNQKFX6GRVTX7X8RDTSTTTVX9MELTSLTSEDTAX10YYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:17)；其中X3選自Y和H；X4選自Y和S；X5選自G、T、A和E；X6選自K和Q；X7選自L和I；X8選自I和T；X9選自Y和H；并且X10選自V和T；或者包含選自以下的氨基酸序列、基本上由選自以下的氨基酸序列組成或由選自以下的氨基酸序列組成EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDYDNILDYVMDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:32)，以及QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFNNYWINWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGDTNYNGKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYIVYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:40)。2.權利要求1的人源化抗體，其在輕鏈中包含CDR區：VLCDR1:KSSQSLLX1SDGKTYLN(SEQIDNO:8)，其中X1選自Y和H；VLCDR2:LVSKLDS(SEQIDNO:9)；以及VLCDR3:VQGTHFP(SEQIDNO:10)。3.權利要求1或2的人源化抗體，其中輕鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQIDNO:11)。4.權利要求3的人源化抗體，其在輕鏈中包含CDR區：VLCDR1:KSSQSLLYSDGKTYLN(SEQIDNO:12)，VLCDR2:LVSKLDS(SEQIDNO:9)；以及VLCDR3:VQGTHFP(SEQIDNO:10)。5.權利要求1的人源化抗體，其中輕鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLAYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQIDNO:13)。6.權利要求5的人源化抗體，其在輕鏈中包含CDR區：SEQIDNO:12的VLCDR1、SEQIDNO:9的VLCDR2和SEQIDNO:10的VLCDR3。7.權利要求1的人源化抗體，其中輕鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQIDNO:14)。8.權利要求7的人源化抗體，其在輕鏈中包含CDR區：SEQIDNO:12的VLCDR1、SEQIDNO:9的VLCDR2和SEQIDNO:10的VLCDR3。9.權利要求1的人源化抗體，其中輕鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQIDNO:15)。10.權利要求9的人源化抗體，其在輕鏈中包含CDR區：VLCDR1:KSSQSLLHSDGKTYLN(SEQIDNO:16)，VLCDR2:LVSKLDS(SEQIDNO:9)；以及VLCDR3:VQGTHFP(SEQIDNO:10)。11.前述權利要求中任一項的人源化抗體，其在重鏈中包含CDR區：VHCDR1:GYSFTGX3TMN(SEQIDNO:18)，其中X3選自Y和H；VHCDR2:LINPX4NX5VTRYNQKFX6G(SEQIDNO:19)；其中X4選自Y和S，X5選自G、T、A和E；并且X6選自K和Q；以及VHCDR3:EAKREWDETY(SEQIDNO:20)。12.權利要求1或權利要求11的人源化抗體，其中重鏈的可變部分因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGVTRYNQKFKGRVTLIRDTSTTTVYMELTSLTSEDTAVYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:21)。13.權利要求12的人源化抗體，其在重鏈中包含CDR區：VHCDR1:GYSFTGYTMN(SEQIDNO:22)，VHCDR2:LINPYNGVTRYNQKFKG(SEQIDNO:23)；VHCDR3:EAKREWDETY(SEQIDNO:20)。14.權利要求1或權利要求11的人源化抗體，其中重鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTAVYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:24)。15.權利要求14的人源化抗體，其在重鏈中包含CDR區：VHCDR1:GYSFTGHTMN(SEQIDNO:25)，VHCDR2:LINPSNGVTRYNQKFQG(SEQIDNO:26)；VHCDR3:EAKREWDETY(SEQIDNO:20)。16.權利要求1或權利要求11的人源化抗體，其中重鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:27)。17.權利要求16的人源化抗體，其在重鏈中包含CDR區：VHCDR1:GYSFTGHTMN(SEQIDNO:25)，VHCDR2:LINPSNGVTRYNQKFQG(SEQIDNO:26)；VHCDR3:EAKREWDETY(SEQIDNO:20)。18.權利要求1或權利要求11的人源化抗體，其中重鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNTVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:66)。19.權利要求18的人源化抗體，其在重鏈中包含CDR區：VHCDR1:GYSFTGHTMN(SEQIDNO:25)，VHCDR2:LINPSNTVTRYNQKFQG(SEQIDNO:67)；以及VHCDR3:EAKREWDETY(SEQIDNO:20)。20.權利要求1或權利要求11的人源化抗體，其中重鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNAVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:68)。21.權利要求18的人源化抗體，其在重鏈中包含CDR區：VHCDR1:GYSFTGHTMN(SEQIDNO:25)，VHCDR2:LINPSNAVTRYNQKFQG(SEQIDNO:69)；以及VHCDR3:EAKREWDETY(SEQIDNO:20)。22.權利要求1或權利要求11的人源化抗體，其中重鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNEVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:70)。23.權利要求21的人源化抗體，其在重鏈中包含CDR區：VHCDR1:GYSFTGHTMN(SEQIDNO:25)，VHCDR2:LINPSNEVTRYNQKFQG(SEQIDNO:71)；以及VHCDR3:EAKREWDETY(SEQIDNO:20)。24.權利要求1的人源化抗體，其中所述抗體輕鏈的可變部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSDGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSG...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M·克萊因施密特，JU·拉赫弗萊德，A·皮肖塔，S·席林，S·吉利斯，
申請(專利權)人：前體生物藥物股份公司，
類型：發明
國別省市：德國,DE