一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法技術(shù)

一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法，在LAMP體系下進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，并將探針固定在芯片表面，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，通過(guò)可見(jiàn)光光學(xué)放大雜交信號(hào)檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)具有較高的特異性與準(zhǔn)確性，操作簡(jiǎn)單，不需要依托大型儀器設(shè)備，滿(mǎn)足醫(yī)院臨床的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法
本專(zhuān)利技術(shù)屬于分子檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，英文名稱(chēng)為loop-mediatedisothermalamplification，是2000年由日本科學(xué)家NotomiT.首次在NucleicAcidsResearch雜志上報(bào)道的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。該方法具有以下特點(diǎn)：具有較強(qiáng)的特異性，只有當(dāng)引物組與靶序列的6-8個(gè)區(qū)域都同時(shí)匹配上時(shí)才能有效擴(kuò)增；反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠且有良好的抗干擾能力，在室溫下放置2周后仍然有效，對(duì)于樣品中原有的或被污染的干擾片段不敏感，而這是其它核酸擴(kuò)增技術(shù)無(wú)法做到的；敏感性較高，擴(kuò)增快速、高效，1h內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物量可達(dá)約1010拷貝數(shù)，擴(kuò)增效率和檢測(cè)靈敏度可比普通PCR高10-100倍左右；結(jié)果鑒別相對(duì)簡(jiǎn)便，多樣化，如檢測(cè)反應(yīng)管的沉淀濁度、檢測(cè)反應(yīng)管顏色變化等方法能判斷擴(kuò)增與否。LAMP技術(shù)對(duì)于樣品處理、操作技術(shù)和儀器設(shè)備的要求都比較低，更適宜現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)或條件較差的基層使用。基因芯片技術(shù)是同時(shí)將大量的探針?lè)肿庸潭ǖ焦滔嘀С治锷?借助核酸分子雜交配對(duì)的特性對(duì)DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效的解讀和分析。采用基因芯片進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)通量大，在一張芯片上可以同時(shí)對(duì)一種病原物的多個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)或者一次性完成幾種病原體檢測(cè)，直接針對(duì)病原體基因進(jìn)行，結(jié)果更準(zhǔn)確，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性好，所需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)的檢測(cè)，是基于熒光標(biāo)記探針的熒光發(fā)光來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的。其信號(hào)弱，必須經(jīng)過(guò)激發(fā)，才能發(fā)光，需要昂貴的激光掃描設(shè)備。本專(zhuān)利技術(shù)基因芯片利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)雜交信號(hào)，在常溫下即可完成雜交過(guò)程，不需要大型儀器設(shè)備，降低了檢測(cè)的投資成本和應(yīng)用成本。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)一種高特異性與準(zhǔn)確性，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀準(zhǔn)確的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法。本專(zhuān)利技術(shù)提供的一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法，包括：第一步，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)配制環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系如下：1.4Mbetaine,200μMdNTPs,1×IsothermalAmplificationBufferⅡ,FIP/BIP引物各1.6μM,F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4Μ，50～150ng/μL的擴(kuò)增模板1μL，總體系25μL。63℃水浴40min擴(kuò)增，80℃水浴10min終止反應(yīng)。第二步，芯片制作取1μL濃度為200ng/μL的探針點(diǎn)樣到NC上，每組設(shè)兩個(gè)平行點(diǎn)樣點(diǎn)，紫外交聯(lián)20min固定探針，使用雜交液封閉30min，真空干燥，4℃保存。第三步，雜交顯色將環(huán)介導(dǎo)恒等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物95℃加熱3分鐘，迅速置于冰上；取10μlPCR產(chǎn)物與2mL雜交緩沖液混合，與芯片一起放入雜交盒中，在常溫下，于水平搖床上孵育60min；使用雜交緩沖液清洗2次，每次5min；清洗后，將親和素（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記）加入到雜交盒中，孵育10min；用洗滌液清洗3次，每次5min；在晾干的基因芯片上點(diǎn)樣ECL顯色液，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯色。進(jìn)一步地，所述的環(huán)介導(dǎo)恒等溫?cái)U(kuò)增引物為：FIP、BIP引物，序列分別為：SEQIDNO.1～2；F3、B3引物，序列分別為：SEQIDNO.3～4；其中BIP引物的5’端帶有生物素標(biāo)記。進(jìn)一步地，所述的探針為：雜交探針，序列為：SEQIDNO.5；對(duì)照探針為：SEQIDNO.6。其中所述的對(duì)照探針5’端帶有生物素標(biāo)記。本專(zhuān)利技術(shù)提供的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高、結(jié)果易于觀察等特點(diǎn)，適合于對(duì)核酸樣本的快速高靈敏診斷。附圖說(shuō)明圖1為陽(yáng)性樣本基因組經(jīng)過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳圖（M：DL2000）。圖2為陽(yáng)性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物雜交結(jié)果。具體實(shí)施例以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案。本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例僅用以說(shuō)明本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本專(zhuān)利技術(shù)技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本專(zhuān)利技術(shù)的權(quán)利要求范圍中。1、目標(biāo)片段引物及探針設(shè)計(jì)通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找銅綠假單胞菌的基因序列，選擇PAK基因的保守序列作為靶標(biāo)（ID為CP020659），通過(guò)LAMP在線引物設(shè)計(jì)軟件(http://primerexplorer.jp/e/index.html)設(shè)計(jì)六個(gè)區(qū)域的三對(duì)引物，F(xiàn)IP、BIP引物的5’端用生物素進(jìn)行標(biāo)記，具體序列如下：FIP、BIP引物，序列分別為：SEQIDNO.1～2;F3、B3引物，序列分別為：SEQIDNO.3～4;LF、BF引物，序列分別為：SEQIDNO.5～6.根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域，設(shè)計(jì)探針P-PAK，序列為：SEQIDNO.72、基因組提取，LAMP擴(kuò)增本試劑盒提供的DNA快速提取試劑為重慶威斯騰生物有限公司提供的EasyExtract，提取步驟如下：取新培養(yǎng)的銅綠假單胞菌液200μL，5000×g離心min收集菌，加入DNA快速提取液80μL，56℃水浴10min，98℃水浴2min，-20℃保存。提取的基因組DNA采用如下體系擴(kuò)增：1.4Mbetaine,200μMdNTPs,2.5μL10×IsothermalAmplificationBufferⅡ,8UBst3.0NDAPolymerase，2μL模板，F(xiàn)IP/BIP引物各1.6μM，F(xiàn)3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4μM，顯色試劑1μL，ddH2O補(bǔ)齊至25μL；將上述所有試劑置于PCR管中，65℃水浴40min擴(kuò)增，80℃水浴10min終止反應(yīng)。3、芯片制備將探針及對(duì)照物探針，按照表1排列分別將探針點(diǎn)樣到NC上，設(shè)兩個(gè)平行點(diǎn)樣點(diǎn)，紫外交聯(lián)20min固定探針。對(duì)照物ProbeT探針序列為SEQIDNO.8表1銅綠假單胞菌芯片矩陣4、雜交顯色雜交步驟如下：a.將LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物95℃加熱3分鐘，迅速置于冰上；b.取10μlPCR產(chǎn)物與2mL雜交緩沖液混合，與芯片一起放入雜交盒中，在常溫下，于水平搖床上孵育60min；c.使用雜交緩沖液清洗2次，每次5min；d.清洗后，將親和素（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記）加入到雜交盒中，孵育10min；e.用洗滌液清洗3次，每次5min；f.在晾干的基因芯片上點(diǎn)樣ECL顯色液，使用上海天能科技有限公司生產(chǎn)的Tanon4600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯色。序列表<110>重慶高圣生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司<120>一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法<160>8<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>36<212>DNA<213>1<400>1ggcgacgggctgtgcaatggactgcgcctgctctgt36<210>2<211>39<212>DNA<本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法，其特征包括：第一步，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)配制環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系如下：1.?4M?betaine?,?200?μM?dNTPs?,?1×Isothermal?Amplification?Buffer?Ⅱ,?FIP/BIP引物各1.6?μM,?F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4Μ，50～150ng/μL的擴(kuò)增模板1μL，總體系25μL，63℃水浴40min擴(kuò)增，80℃水浴10min終止反應(yīng)；第二步，芯片制作取1μL濃度為200ng/μL的探針點(diǎn)樣到NC上，每組設(shè)兩個(gè)平行點(diǎn)樣點(diǎn)，紫外交聯(lián)20min固定探針，使用雜交液封閉30min，真空干燥，4℃保存；第三步，雜交顯色將環(huán)介導(dǎo)恒等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物?95℃加熱?3?分鐘，迅速置于冰上；取10μl?PCR產(chǎn)物與2mL雜交緩沖液混合，與芯片一起放入雜交盒中，在常溫下，于水平搖床上孵育60min；使用雜交緩沖液清洗2次，每次5min；清洗后，將親和素（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記）加入到雜交盒中，孵育10min；用洗滌液清洗3次，每次5min；在晾干的基因芯片上點(diǎn)樣ECL顯色液，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯色。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合基因芯片的檢測(cè)方法，其特征包括：第一步，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)配制環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系如下：1.4Mbetaine,200μMdNTPs,1×IsothermalAmplificationBufferⅡ,FIP/BIP引物各1.6μM,F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4Μ，50～150ng/μL的擴(kuò)增模板1μL，總體系25μL，63℃水浴40min擴(kuò)增，80℃水浴10min終止反應(yīng)；第二步，芯片制作取1μL濃度為200ng/μL的探針點(diǎn)樣到NC上，每組設(shè)兩個(gè)平行點(diǎn)樣點(diǎn)，紫外交聯(lián)20min固定探針，使用雜交液封閉30min，真空干燥，4℃保存；第三步，雜交顯色將環(huán)介導(dǎo)恒等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物95℃加熱3分鐘，迅速置于冰上；取10μlPCR產(chǎn)物與2mL雜交緩沖液混合，與芯片一起...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周勇，項(xiàng)周，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：重慶高圣生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：重慶,50