在結合了轉錄/轉譯的無細胞體系中制備性表達基因的方法技術

制備性基因表達是在結合了轉錄／轉譯的無細胞體系中實現的，體系中作為基質含有氨基酸，ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ和ＵＴＰ，使用呈ＤＮＡ分子形式的基因，其結果在體系中生成基因表達產物，包括多肽，ＡＭＰ，ＡＤＰ，ＧＤＰ，ＣＤＰ，ＵＤＰ，焦磷酸鹽和無機磷酸鹽。在轉錄／轉譯的無細胞體系的工作過程中，隨著基質的消耗和產物的生成，從體系中取出基因表達產物，包括多肽，ＡＭＰ，ＡＤＰ，ＧＤＰ，ＣＤＰ，ＵＤＰ，焦磷酸鹽和無機磷酸鹽。同時往體系中加入呈氨基酸，ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ形式的基質，以保持它們的原始濃度。（*該技術在2009年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物學和生物技術，即涉及。眾所周知，基因表達產物是肽或蛋白質。這些物質作為生物過程的生物調節劑，醫療藥劑及診斷系統，廣泛應用于醫學上。例如，已知有免疫系統的肽活性劑，鹽交換的肽刺激劑，蛋白質，血中糖量的調節劑及其它。已知多肽在農業中作為生物刺激劑例如生長激素的應用。已知通過基因工程技術來制備性表達細胞的遺傳材料的方法，該基因工程是基于把遺傳材料通過宿主細胞器表達的異種DNA引入到活細胞內實現的。這種基因工程廣泛用于蛋白質的工業生產。但是它在應用方面有一定的限制性。這是由于基因表達產物分離的復雜性，宿主細胞的某些目標產物的致死以及異種基因表達產物受到細胞蛋白酶的降解或聚集所引起的。后一種情況會使長度有15-70氨基酸殘基的多肽的分離或使有人工改變的氨基酸順序的蛋白質生產特別困難。由上面的情況得到的結論是基因工程的方法不確保制備性表達任何基因的可能性。還有一種基因表達方法，它是基于利用結合了轉錄/轉譯的無細胞體系。這方法是基于使用DNA分子的細胞提取物。在這種體系中產生mRNA與DNA分子的擴增及其以后的轉譯。結合了轉錄/轉譯的無細胞體系沒有由細胞造成的限制，實際上保證了按適當方式所設計的呈DNA形式的任何基因的表達。但是，這些方法的效率是非常低的。這種體系發揮功能的時間為20-60分鐘，合成的多肽數量相對1毫升培育混合物不超過3-10微微摩爾。就這樣，例如，已知在結合了轉錄/轉譯的無細胞體系中基因表達方法(基因，Vol.6，1979)。根據這個方法，100微升結合了轉錄/轉譯的無細胞體系含25微升提取物S30，5微克DNA分子，19微克總tRNA，1.7毫摩爾ATP，GTP，CTP和UTP各1毫摩爾，88微摩爾cAMP，0.5微克葉酸，37毫摩爾磷酸烯醇丙酮酸，2.6%聚乙二醇6000，88微摩爾〔35S〕蛋氨酸，其它19種氨基酸各480微摩爾在緩沖液中77毫摩爾Tris-醋酸鹽(pH8.2)，13毫摩爾醋酸鎂，13毫摩爾醋酸鈣，100毫摩爾醋酸鉀，50毫摩爾醋酸銨，2.4毫摩爾DTT。在溫度37℃下進行基因表達。在合成過程中，在體系中積累起基因表達產物，包括呈多肽形式的目標產物，呈AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸鹽，無機磷酸鹽形式的分解產物及其它產物，這些都是基因表達體系的抑制劑。由于有抑制作用，過30-60分鐘系統停止自己的功能。在100微升這樣的系統中，合成的多肽數量不超過0.5-1微微摩爾。結合了轉錄/轉譯的無細胞體系發揮功能持續時間短的主要原因在于1.體系含有有限量的基質，提高它的含量會抑制體系。2.在體系進行工作中生成的呈AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸鹽和磷酸鹽形式的分解產物是體系抑制劑。3.目標產物也會抑制結合了轉錄/轉譯的無細胞體系。本專利技術的任務是要在結合了轉錄/轉譯的無細胞體系中制備性表達呈DNA分子形式的基因的方法，用這種方法通過延長體系發揮功能的持續時間可得到制備級數量的多肽。這個任務是通過下面的途徑來解決，即推薦出這樣一個，在體系中作為基質有氨基酸，ATP，GTP，CTP和UTP，并利用呈DNA分子形式的基因，生成基因表達產物，包括多肽，AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸鹽，無機磷酸鹽，在該方法中，按照本專利技術，在結合了轉錄/轉譯的無細胞體系發揮功能過程中，隨著基質的消耗，產物的生成，從體系中不斷取出基因表達產物，包括多肽，AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸鹽和無機磷酸鹽，同時不斷往體系中加入呈氨基酸，ATP，GTP，CTP，UTP形式的基質，以保持它們原來的濃度。作為本推薦方法中的基因表達體系，即可利用結合了轉錄/轉譯的原核無細胞體系，也可利用真核無細胞體系。在所推薦的方法中，使用的反應混合物組分的比例關系，合成的離子和溫度條件，都是所選系統最佳的條件。這些條件的范圍很寬，是由制備無細胞體系的有機體性質決定的。所推薦的制備性表達基因方法，沒有基因工程方法的限制，可用于任何肽和蛋白質的基因表達。這個性質對得到生物活性的肽和帶有人工改變氨基酸順序的蛋白質特別重要。所推薦的方法確保結合了轉錄/轉譯的無細胞體系中的基因表達在50小時或更長的時間里有固定不變的高速度。在體系50-100小時的工作時間里，由1毫升反應混合物得到200-400微克目標產物，這有可能使基因表達產物的生產工業化。下面，通過完成的實例及所附的圖來說明本專利技術，圖中示出了合成的多肽數量與合成時間的關系曲線。在結合了轉錄/轉譯的無細胞體系中制備性表達基因方法的實現如下從原核細胞或真核細胞制備含所有轉錄和轉譯所需組分，但沒有內源mRNA和DNA的提取物。往提取物中加入轉錄和轉譯的低分子量組分(氨基酸，ATP，GTP，UTP，CTP)，以及呈DNA分子形式的基因。把反應混合物加入到貯藏器內，在那里進行結合了的轉錄/轉譯過程。為了防止反應過程的停止，通過半透膜不斷從貯藏器中取出轉錄產物(無機磷酸鹽，ADP，GDP，CDP，UDP)和轉譯產物(合成的多肽，AMP，GDP，無機磷酸鹽和焦磷酸鹽)。同時，往貯藏器內加入氨基酸，ATP，GTP，CTP，UTP，以恢復它們的初始濃度。使用裝有吸附劑的柱子收集合成的多肽，同時在專用的貯藏器內收集轉錄和轉譯產物，供以后再生用。為了更好理解本專利技術，在下面列出具體的實施例。在無細胞體系中制備性表達質粒PUD18的基因制備結合了轉錄/轉譯的標準無細胞體系，質粒PUD18含有β-內酰胺酶和二氫葉酸還原酶基因。溶液(A)含有55毫摩爾Tris-醋酸鹽(pH8.2)，11毫摩爾醋酸鎂，9.5毫摩爾氯化鈣，76毫摩爾醋酸鉀，1.5毫摩爾DTT，1.6%聚乙二醇6000，5毫摩爾磷酸烯醇丙酮酸，1.2毫摩爾ATP，GTP，CTP和UTP各0.8毫摩爾，5微克/毫升葉酸，100微摩爾〔3H〕白氨酸，其比放射活性為230毫居里/毫摩爾，其它氨基酸各100微摩爾。1毫升由緩沖液A制得的反應混合物，含430微升提取物S30，150微克質粒PUD18，200微克總tRNA。在溫度37℃下，在40分鐘培育時間內，結合了轉錄/轉譯的標準體系，由每1毫升培育混合液合成出β-內酰胺酶和二氫葉酸還原酶各6微微摩爾。在平行實驗中，在一個連續作用的裝置內，以3毫升/小時或2毫升/小時的速度往1.0毫升反應混合物內加入溶液(A)，同時以同樣的速度，通過超濾膜XM-100(荷蘭AMnKoH公司生產)從反應混合物中取出反應產物。在圖中示出了這種體系內β-內酰胺酶和二氫葉酸還原酶基因表達的動力學，圖中橫座標為合成的時間t(小時)，縱坐標為生成的產物的數量m(微克)。在動力學曲線1段，溶液(A)以3毫升/小時的速度加入，在動力學曲線2段，溶液(A)以2毫升/小時的速度加入。由所給的圖可知，多肽的合成速度取決于溶液(A)的加入速度，不取決于系統的工作時間。這樣的體系在50小時的工作時間內，每1毫升反應混合物合成出β-內酰胺酶和二氫葉酸還原酶各4.1微微摩爾，這相應于212微克β-內酰胺酶和二氫葉酸還原酶的蛋白質。這樣，推薦的本方法保證了在無細胞體系中制備性表達基因，產物的產率比結合了轉錄/轉譯的標準無細胞體系所合成的產物高500倍以上。權利要求1.一種，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種在結合了轉錄／轉譯的無細胞體系中制備性表達基因的方法，體系中作為基質有氨基酸、ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ和ＵＴＰ，利用呈ＤＮＡ分子形式的基因，在體系中生成的基因表達產物，包括多肽，ＡＭＰ，ＡＤＰ，ＧＤＰ，ＣＤＰ，ＵＤＰ，焦磷酸鹽，無機磷酸鹽，該方法的特點是，在轉錄／轉譯的無細胞體系工作過程中，隨著基質的消耗和產物的生成，從體系中取出基因表達產物，包括多肽，ＡＭＰ，ＡＤＰ，ＧＤＰ，ＣＤＰ，ＵＤＰ，焦磷酸鹽和無機磷酸鹽，同時往體系中加入呈氨基酸，ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ形式的基質，其目的是為了保持它們的原始濃度。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：弗拉基米爾伊萬諾維奇巴拉諾夫，伊格爾米麗維奇莫羅佐夫，亞利山大賽格維奇斯比林，
申請(專利權)人：蘇聯科學院蛋白質研究所，
類型：發明
國別省市：SU[蘇聯]