用清蛋白聚合的血清親合結(jié)合法純化乙型肝炎表面抗原前-Ｓ-區(qū)制造技術(shù)

重組體前－Ｓ－ＨＢｓＡｇ通過(guò)快速有效兩步層析法純化。破碎表達(dá)重組體前－Ｓ－ＨＢｓＡｇ的酵母細(xì)胞，澄清細(xì)胞內(nèi)含物，用聚合人類(lèi)血清清蛋白親合層析分離該內(nèi)含物，前－Ｓ－ＨＢｓＡｇ進(jìn)一步用丁基瓊脂糖疏水反應(yīng)層析純化。這一過(guò)程得到高于９０％純度的前－Ｓ－ＨＢｓＡｇ。（*該技術(shù)在2007年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及純化酵母表達(dá)的重組體前-S-Hepatitis B表面抗原(HBsAg，前S-肝炎B)的一種快速有效方法。已證實(shí)該表面抗原肝炎B前-S區(qū)是病毒受體位點(diǎn)，在肝炎B病毒進(jìn)入肝細(xì)胞之前，該區(qū)結(jié)合于肝細(xì)胞，Valenzuela et al，Bio/Technology 3∶317-320(1985)，該前-S區(qū)結(jié)合于聚合的血清清蛋白，認(rèn)為聚合的血清清蛋白與肝細(xì)胞膜有關(guān)，因此，含有前-S的，衍生的重組體抗原被稱作可誘導(dǎo)抗體的一類(lèi)抗原，這些抗體能阻斷肝炎B病毒與感受性宿主細(xì)胞的接觸。肝炎B病毒含有前-S的表面抗原已從感染的人類(lèi)血漿中分離得到，Neurath and Strick，Arch.Virol 6079-81(1979)，最近并用Valenznela，supra描述的標(biāo)準(zhǔn)重組體技術(shù)得到。事實(shí)上，Neurath和Strick能采用與人類(lèi)聚合的血清清蛋白選擇性結(jié)合的方法從HBeAg陽(yáng)性人類(lèi)血清中分離小量HBsAg。該HBsAg可用3M硫氰酸鈉從連接了聚合的人類(lèi)血清清蛋白的瓊脂糖柱上洗脫。以此方法得到了25倍到80倍純化血清HBsAg。然而，這一程序不能純化重組體衍生的前-S(2)HBsAg。重組體前-S-HBsAg用快速有效兩步層析方法純化。破裂表達(dá)重組體前-S-HBsAg的酵母細(xì)胞，澄清該細(xì)胞內(nèi)含物并用聚合的人類(lèi)血清清蛋白親合層析法分離。該前-S-HBsAg可用丁基瓊脂糖疏水作用親合層析進(jìn)一步純化。這種方法得到高于90%純度的前-S-HBsAg。因此，本專利技術(shù)目的之一是提供一有效方法以純化重組體衍生前-S-HBsAg。另一目的是提供一種方法，其允許快速，高純度高產(chǎn)率重獲前-S-HBsAg。本專利技術(shù)的這些目的和其它目的可從下文敘述中看出。本專利技術(shù)涉及一快速兩步方法從酵母細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中分離前-S抗原，在這種酵母細(xì)胞中該肽段是用重組體技術(shù)產(chǎn)生的。當(dāng)下列敘述和實(shí)例描述與前-S(2)-HBsAg相關(guān)的本專利技術(shù)時(shí)，應(yīng)明了本專利技術(shù)適用于任何含有與肝炎B表面抗原-S區(qū)相關(guān)的肽段的蛋白質(zhì)。實(shí)例包括重組體衍生的前-S(1)S(2)-HBsAg，及未與肝炎B病毒表面抗原S區(qū)共價(jià)結(jié)合的前-S(1)S(2)和前-S(2)多肽。表達(dá)前-S(2)HBsAg的重組體酵母用Valenzuela et al。敘述的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)得到，Bio/Technology，3317-320(1985)，表達(dá)前-S(2)-HBsAg的酵母細(xì)胞用Carty et al方法生長(zhǎng)，Eighty-Fourth ASM Meeting p.194，1984，收集這些細(xì)胞，離心并重懸于含約0.1M磷酸鈉，約PH7.2，0.5MNacl的高滲緩沖液，濃度約50%(Wt/wt)，貯于-70℃。細(xì)胞在約20-23℃時(shí)融解，離心并重懸于Breaking緩沖液，其中含約0.1M HEPES，PH7.5，補(bǔ)充有0.01M EDTA，1μg/ml抑胃肽，0.13單位/ml aprotinin0.01M苯胺-鹽酸及2mM苯基-甲烷，磺酸(PMSF)。該混合物1-7次通過(guò)Stansted壓機(jī)以破裂細(xì)胞。破裂細(xì)胞漿液通過(guò)離心8，000xg 45分鐘4℃而澄清。澄清的酵母提取物加入-含有偶聯(lián)了聚合的人類(lèi)血清清蛋白(PHSA)的Sepharose4B柱。人類(lèi)血清清蛋白是按Machi-da et al，Gastroent 85268-274(1983)敘述的方法用戊二醛聚合的，按廠家要求偶聯(lián)于CNBr-激活的Sepharose 4B。用一合適洗脫液洗，用含50mMHEPES PH7.5和0.5N Nacl的緩沖液A洗，然后將酵母提取液上柱。合適洗脫液包括堿金屬的一，二或三鹵代醋酸鹽。堿金屬指鋰鈉，鉀，其中鈉最為常用。鹵素指氟，氯，溴和碘，其中氯最常用。因此，最常用為三氯醋酸鈉。當(dāng)所有樣品進(jìn)入柱子，不被吸收的蛋白質(zhì)就用緩沖液A從柱中洗掉。吸收的前-S(2)-HBsAg用三氯醋酸鈉水溶液從PHSA Sepharose柱中洗掉，三氯醋酸鈉濃度1M-3.5M，最好用3M，PH6-8，最好用PH7。PHSA親合分離得到80倍富集的前-S(2)-HBsAg。聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移和銀染證明所分離的組分為前-S(2)-HBsAg，純度至少為50%。該前-S(2)-HBsAg進(jìn)一步用丁基Sepharose(Pharmacia)層析純化。特別純化了的前-S(2)-HBsAg對(duì)50mM3-(N-嗎啉)丙烷磺酸(MOPS)PH7.0透析，泵入丁基Sepharose 4B柱，沖洗該柱，用約0.1% triton x-100，50mM MOPS，PH7.0將結(jié)合的前-S(2)-HBsAg洗脫，聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移和銀染證明洗脫出的前-S(2)-HBsAg組分純度大于90%。以下各例用于說(shuō)明本專利技術(shù)，但不是對(duì)本專利技術(shù)的限制。例1用聚合的人類(lèi)血清清蛋白親合層析純化前-(S)-HBsAg表達(dá)前-S(2)-HBsAg的重組體衍生酵母用Valen-zuela et al，Bio/Technology 3317-320，1985，所述標(biāo)準(zhǔn)組技術(shù)得到，細(xì)胞用Cartyetal，Eighty-Fourth ASM Metting，1984，Abstr 030，P194，所述方法生長(zhǎng)，濃縮富集，對(duì)磷酸鹽緩沖液PH7.2透析過(guò)濾，離心收集細(xì)胞，重懸于高滲緩沖液(0.1M磷酸鈉，PH7.2，0.5M NaCl)，以-50%細(xì)胞懸液(Wt/wt)貯于-70℃。非特別指明，所有工作均在4℃完成、冰凍細(xì)胞懸浮液于20℃融解，至漿液具有半融稠度。細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至一已事先稱重的離心瓶中，攪動(dòng)至全部融解。于8000xg離心45分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞154gm(濕重)與250ml破碎緩沖液(0.1M HEPES，PH7.5，0.01MEDTA，1μS/ml抑胃肽A，0.13 units/ml aprotinin，0.01M苯胺鹽酸，2mM PMSF)混合準(zhǔn)備裂解，細(xì)胞均勻分布然后通過(guò)-Stansted壓機(jī)，80每平方吋克，10-12每平方吋克回壓。破碎重復(fù)四次，8000xg離心45分鐘收集上清液。人類(lèi)血清清蛋白用戊二醛聚合，如Machida et al，Gas-troentero，85268-74，1983，所述，根據(jù)廠家指導(dǎo)偶聯(lián)于CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia)。制備聚合人類(lèi)血清清蛋白(PHSA)結(jié)合Sepharose柱，床體積64ml，用300ml3M三氯醋酸鈉PH7洗，再用700ml緩沖液A洗，緩沖液A含有50mM HEPES，0.5M Nacl和PH7.5。澄清的酵母提取液440ml(含20，520mg蛋白質(zhì)和129mg前-S(2)，HBsAg)被泵入PHSA Seph-arose柱，流速25ml/hour，全部樣品進(jìn)柱后，用緩沖液A洗去末被吸收的蛋白質(zhì)。前-S(2)-HBsAg用3M三氯醋酸鈉PH7洗脫，檢測(cè)和純度分析前-S(2)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種純化重組體表達(dá)的肝炎Ｂ病素前—Ｓ表面抗原的方法，包括：ａ．將含前（２）的抗原連接于聚合的血清清蛋白母體入；ｂ．將該抗原從母體上洗脫，用鹵代醋酸堿金屬鹽；及ｃ．用丁基瓊脂糖親合層析及一合適的洗脫劑進(jìn)行最后純化。

【技術(shù)特征摘要】
US 1986-4-25 8563251.一種純化重組體表達(dá)的肝炎B病毒前-S表面抗原的方法，包括a.將含前(2)的抗原連接于聚合的血清清蛋白母體入；b.將該抗原從母體上洗脫，用鹵代醋酸堿金屬鹽；及c.用丁基瓊脂糖親合層析及一合適的洗脫劑進(jìn)行最后純化。2.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟a中的清蛋白是人類(lèi)或黑猩猩的血清清蛋白。3.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟a中的清蛋白是人類(lèi)血清清蛋白。4.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟a中的抗原是前-S(2)-HBsAg，前-S(1)S(2)-HBsAg，前-S(1)S(2)或前-S(2)。5.據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，在步驟b中的堿...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：E戴爾萊曼，特德F謝弗，威廉J麥卡里爾，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：默克公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：US[美國(guó)]