一種人臍帶間充質干細胞的無血清培養基制造技術

本發明專利技術提供一種人臍帶間充質干細胞的無血清培養基，屬于干細胞培養技術領域，用于臨床應用的人臍帶間充質干細胞培養的改進方法以及改進的人臍帶間充質干細胞的培養組合物。其中基礎培養基為Alpha?MEM培養基，添加成份明確的血清替代物一種或者多種：營養因子，血小板源性因子，表皮生長因子，堿性成纖維生長因子，細胞因子抗體，蛋白多肽，植物提取物等。人臍帶間充質干細胞在上述培養基中傳代培養及擴增之后對培養細胞表面標記分析，生長曲線結果顯示人臍帶間充質干細胞的活率提高，流式結果顯示人臍帶間充質干細胞的特性穩定，其中不含血清，避免了血清成份對細胞培養的影響，防止了外源性不明成分和病原性污染，有效保證干細胞治療產品的質量穩定和標準化，為用于臨床治療奠定了方法學基礎。

A serum-free medium for human umbilical cord mesenchymal stem cells

【技術實現步驟摘要】
一種人臍帶間充質干細胞的無血清培養基
本專利技術涉及干細胞培養
，具體地說是一種人臍帶間充質干細胞的無血清培養基和提高干細胞活率的方法。
技術介紹
人臍帶間充質干細胞是指從人臍帶中分離的一種多能干細胞，與其他來源的間充質干細胞比較有較明顯的臨床應用優勢，如取材容易、易收集、冷凍保存及相對純凈等，具有較高的分化潛能，可向多個方向進行分化，如成骨細胞、軟骨細胞、類肝細胞、類胰島素細胞、神經細胞和心肌細胞等，且無倫理方面的問題。目前，人臍帶間充質干細胞已經在臨床領域得到應用并取得令人鼓舞的治療效果。干細胞增殖數量、活率以及無外源性污染是人臍帶間充質干細胞在臨床治療應用中獲得療效與安全的關鍵，一方面由于常規培養基中含有各種不明確的細胞生長因子，會對細胞的分化形成干擾，另一方面采用動物血清培養的干細胞進行臨床應用，可能引起病原體的交叉感染，因此需要開發成分明確的無血清培養基。促進干細胞自我增殖的細胞因子對于開發無血清培養基具有重要的意義，而添加的特定細胞因子抗體則可防止細胞出現分化的特征，添加的植物提取物則可有效的促進細胞的活率，市場上存在的無血清干細胞培養基用于培養人臍帶間充質干細胞時，細胞會出現生長緩慢和分化的特征，影響了干細胞的自我復制能力，在一定程度上阻礙了人臍帶間充質干細胞的臨床治療應用，因此現有的技術需要改進和發展。
技術實現思路
本專利技術的技術任務是解決現有臨床應用中的不足，提供一種人臍帶間充質干細胞的無血清培養基和提高干細胞活率的方法，解決血清中帶來的動物源性成分和病原體污染問題，促進細胞增殖并維持干細胞特性。本專利技術的技術方案是按以下方式實現的，一種人臍帶間充質細胞在無血清的人臍帶間充質干細胞培養基中傳代培養及擴增的實驗方法，該實驗方法的步驟是：首先制備人臍帶間充質干細胞的無血清培養基，該培養基包括基礎培養基和添加營養因子成份，其中，基礎培養基為Alpha-MEM培養基，根據需要添加如下成份中的一種或者多種：1.營養因子A（1ng/mL-100ng/mL）；2.營養因子B（1ng/mL-100ng/mL）；3.血小板源性因子（1ng/mL-100ng/mL）；4.表皮生長因子（1ng/mL-100ng/mL）；5.堿性成纖維生長因子（1ng/mL-100ng/mL）；6.細胞因子抗體A（1ng/mL-100ng/mL）；7.細胞因子抗體B（1ng/mL-100ng/mL）；8.細胞因子抗體C（1ng/mL-100ng/mL）。根據需要添加如下成份中的一種或者多種，優化以后的劑量：1.營養因子A（20ng/mL-50ng/mL），2.營養因子B（20ng/mL-50ng/mL），3.血小板源性因子（20ng/mL-50ng/mL），4.表皮生長因子（20ng/mL-50ng/mL），5.堿性成纖維生長因子（20ng/mL-50ng/mL），6.細胞因子抗體A（20ng/mL-50ng/mL），7.細胞因子抗體B（20ng/mL-50ng/mL），8.細胞因子抗體C（20ng/mL-50ng/mL）。已知成分的培養基是完全不含動物來源組分的，并且不含人源的白蛋白復雜混合物，在某些實施方式中，組合物包含化學成分確定的培養基和一種或多種的組分因子，例如營養因子、生長因子、細胞因子抗體等。培養基包括相應的明確的營養成分：氨基酸、維生素、鹽類、脂類。培養基還包括成分明確的蛋白多肽，也可加入經無菌及無病原體安全處理后的植物抽提物，培養基的制備是依次將基礎培養基、蛋白多膚和細胞因子和植物提取物加入到培養基中。其中植物提取物來自玫瑰花、蘆薈、人參、肉蓯蓉、紅花、桃仁、茉莉花提取物。所述人臍帶間充質干細胞無血清培養基包括以下一種或者多種組分：玫瑰花抽提物，10-50mg/L；蘆薈抽提物，10-50mg/L；人參抽提物，10-50mg/L；肉蓯蓉抽提物，10-50mg/L；紅花提取物，10-50mg/L；桃仁提取物，10-50mg/L；茉莉花提取物，10-50mg/L。取以上植物成分：玫瑰花、蘆薈、人參、肉蓯蓉、紅花、桃仁、茉莉花，分別榨汁收集汁液，采用2000g離心，去除碎片獲取上清液，再采用0.22um濾膜過濾，去除混在上清液中的細胞碎片，也可采用分級無菌超濾分離機進行截留，此處所述分級超濾分離機，是由電磁供料泵、耐震壓力表、無菌原料罐、壓力表、無菌管道支架和1000D和50KD無菌有機濾膜等配件連接組成。獲得的上清液通過濾膜的順序為：先通過50KD有機濾膜，收集低于50KD的營養因子液，然后將營養因子液用電磁泵再次打入1000D有機濾膜，收集到營養濃縮液，根據工藝需要，通過反復濃縮可以將營養因子液體積濃縮為原收集上清液體積的1/50既可，測定提取的植物精華液，分裝以后備用。以上成分可保護細胞免受理化因素損傷并支持人臍帶間充質干細胞分泌生成細胞因子。人臍帶間充質干細胞在上述培養基中傳代培養及擴增的實驗步驟是：1）細胞復蘇步驟：a．從液氮罐中快速取出1管細胞至備有液氮的冰盒中，待用；b．打開水浴鍋至37℃；c．用10mL移液管吸取9mL完全培養基至15mL離心管中，待用；d．用鑷子從冰盒中夾出細胞，在37℃水浴中快速解凍，輕輕搖晃，直至只有一小塊冰坨，復蘇時間控制在2min以內；e．用100-1000uLTip頭將復蘇好的細胞吸至離心管中，輕晃混勻，Tip頭可吸取少量離心管中的細胞懸液清洗一遍凍存管，400g，室溫離心3min；f．用移液管向1個T75培養瓶中加入7mL完全培養基；離心完，倒去上清，擦拭管口，加入8mL完全培養基重懸細胞，吹打10次混勻，取20uL細胞懸液用于計數，接種至培養瓶中；g．培養瓶上手動標記細胞名稱、復蘇代數和復蘇日期，放至37℃，5%CO2培養箱中培養；h．20uL細胞懸液用配制好的臺盼藍染液（0.4%臺盼藍染液用PBS稀釋1倍）稀釋2倍計數；i.操作完，整理生物安全柜和桌面，放入下次操作時需用耗材，紫外照射消毒30min。2）傳代培養步驟（以T75cm2培養瓶為例）：a．顯微鏡下觀察細胞生長狀態，當細胞匯合度至80%時，按1:3比例傳代；b．從培養箱中取出細胞，倒去廢液，擦拭瓶口，用5mL移液管吸取5mL生理鹽水將細胞洗一遍（注：不要直接吹打細胞），輕晃培養瓶，吸去廢液；c．吸取2mL0.25%Trypsin-EDTA加入到培養瓶內，丟棄移液管，輕輕搖晃培養瓶使液體覆蓋整個培養瓶，5%CO2培養箱中放置3min，在顯微鏡下觀察細胞，用手掌輕輕拍打培養瓶確保細胞完全從培養瓶底壁脫落；d．用5mL移液管吸取2mL完全培養基至培養瓶內，吹打10次混勻，移入1個15mL離心管中，混勻，丟棄移液管；e．用5mL移液管吸取5mL生理鹽水將培養瓶中殘留的細胞洗一遍，移入上述15mL離心管中，丟棄移液管，400g，室溫離心3min；f．倒去上清，擦拭管口，用10mL移液管吸取32mL完全培養基至1個T225培養瓶中；再吸取8mL完全培養基重懸細胞，吹打10次混勻，取20uL細胞懸液用于計數，接種至培養瓶中；g．培養瓶上手動標記細胞名稱、傳代代數和傳代日期，放至37℃,5%CO2培養箱中培養；h.20uL細胞懸液用配制好的臺盼藍染液（0.4%臺盼藍染液用PBS稀釋1倍）稀釋5倍計數；i．操作完本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人臍帶間充質干細胞的無血清培養基，基礎培養基為Alpha?MEM培養基，根據需要添加如下成份中的一種或者多種：1）營養因子A（1?ng/mL??100?ng/mL）；2）營養因子B（1?ng/mL??100?ng/mL）；3）血小板源性因子（1?ng/mL??100?ng/mL）；4）表皮生長因子（1?ng/mL??100?ng/mL）；5）堿性成纖維生長因子（1?ng/mL??100?ng/mL）；6）細胞因子抗體A（1?ng/mL??100?ng/mL）；7）細胞因子抗體B（1?ng/mL??100?ng/mL）；8）細胞因子抗體C（1?ng/mL??100?ng/mL）。

【技術特征摘要】
1.一種人臍帶間充質干細胞的無血清培養基，基礎培養基為Alpha-MEM培養基，根據需要添加如下成份中的一種或者多種：1）營養因子A（1ng/mL-100ng/mL）；2）營養因子B（1ng/mL-100ng/mL）；3）血小板源性因子（1ng/mL-100ng/mL）；4）表皮生長因子（1ng/mL-100ng/mL）；5）堿性成纖維生長因子（1ng/mL-100ng/mL）；6）細胞因子抗體A（1ng/mL-100ng/mL）；7）細胞因子抗體B（1ng/mL-100ng/mL）；8）細胞因子抗體C（1ng/mL-100ng/mL）。2.根據權利1要求所述的人臍帶間充質干細胞無血清培養基組合物,其中培養基包含一種或多種生長因子或細胞因子，可選擇的添加成份以及優化以后的劑量如下：1）營養因子A（20ng/mL-50ng/mL）；2）營養因子B（20ng/mL-50ng/mL）；3）血小板源性因子（20ng/mL-50ng/mL）；4）表皮生長因子（20ng/mL-50ng/mL）；5）堿性成纖維生長因子（20ng/mL-50ng/mL）；6）細胞因子抗體A（20ng/mL-50ng/mL）；7）細胞因子抗體B（20ng/mL-50ng/mL）；8）細胞因子抗體C（20ng/mL-50ng/mL）。3.根據權利1要求所述的人臍帶間充質干細胞無血清培養基組合物，對于原代細胞的臍帶間充質干細胞無血清培養基組合物，其中可添加植物提取物來自玫瑰花，蘆薈，人參...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉劼，孫毅，薛婷，陳彩琴，廖方圓，朱益輝，黃明輝，
申請(專利權)人：劉劼，孫毅，朱益輝，黃明輝，
類型：發明
國別省市：上海,31