香蕉枯萎病抗性分子標記及其應用制造技術

本發明專利技術公開一種鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標記，該分子標記具有如SEQ?ID：4所示的核苷酸序列。本發明專利技術還公開一種用于擴增SCAR分子標記的引物、包含引物的試劑盒以及上述分子標記、引物、試劑盒在鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選抗枯萎病的香蕉中的應用。本發明專利技術還公開一種鑒定香蕉枯萎病抗性的方法，以香蕉葉片DNA為模板，采用上述引物進行PCR擴增反應并檢測擴增產物，具體表現為檢測296bp特異性條帶的有無。本發明專利技術提供的SCAR分子標記，為香蕉抗病新品種選育提供分子輔助技術，進一步可用于以香蕉組培苗、香蕉田間變異株系以及物理化學誘變后代等為篩選群體的香蕉新品種(系)的輔助篩選。

Molecular markers and application of resistance to Fusarium Wilt of banana

SCAR molecular marker of the invention discloses a method for identification of Banana Fusarium wilt disease resistance, the molecular marker has the nucleotide sequence of SEQ is shown in ID:4. The invention also discloses a primer for amplification of SCAR molecular markers, a kit containing primers, and the application of the above molecular markers, primers and kits in identifying Banana Fusarium wilt resistance or screening blight resistant bananas. The invention also discloses a method for identifying resistance to Fusarium Wilt of banana. Taking banana leaf DNA as template, the above primers are used for PCR amplification reaction and detection of amplification products, specifically for detecting 296bp specific bands. The SCAR molecular marker provided by the invention provides molecular assistant technology for the breeding of banana disease resistant new varieties, and can further be used for auxiliary screening of Banana New Varieties (lines) which are screened by banana tissue culture seedling, banana field variation strain and physical and chemical mutation offspring.

【技術實現步驟摘要】
香蕉枯萎病抗性分子標記及其應用
本專利技術涉及香蕉枯萎病抗性分子標記，具體涉及一種香蕉枯萎病抗性鑒定的SCAR分子標記、分子標記引物、試劑盒、應用及方法。
技術介紹
香蕉是世界重要的一種水果，全世界栽培香蕉的國家達到130個。香蕉出口是熱帶亞熱帶地區創匯的主要手段，在其國民生產總值中占有相當的比重。我國是香蕉的主產國之一，香蕉產業在我國南亞熱帶地區農業產值中占有很重要的位置。香牙蕉(MusaAAACavendishsubgroupcv.)是世界第一大種植品種，也是我國主栽的香蕉類型。但是香牙蕉受到香蕉枯萎病4號生理小種的嚴重侵害，甚至是毀滅性的危害。目前，香蕉枯萎病已成為香蕉產業發展最大的障礙，受到國際廣泛關注。該病害是一種土傳病害，通過化學防治和農業防治尚不能有效地防控此病。種植香蕉枯萎病抗病品種是經濟有效的途徑，因此，香蕉枯萎病抗病品種選育是當前香蕉產業中重要的環節。目前生產上應用的栽培香蕉多數為三倍體(2n＝3x＝33)，具有單性結果、多倍性、高度不育、沒有種子等特性，這為香蕉的常規雜交育種帶來了極大的困難，抗病育種就更困難了。目前香蕉新品種選育途徑主要是田間變異、組織培養變異利用、物理化學誘變等，但變異率較低，其中有用的變異率更低，并且篩選需要的人力物力大、選育周期長，造成了香蕉品種更新慢，病蟲害高發的現狀。隨著當今生物技術的迅速發展，香蕉分子生物學技術逐步受到研究者重視。香蕉的抗病分子育種是研究熱點和重點，但是還處于起步階段，目前的研究主要集中在對香蕉的抗病基因類似物分析、香蕉抗病相關分子標記開發以及香蕉抗病機理等研究方面。孟祥春等(2007，分子植物育種S1：57-60)利用植物NBS類抗病基因保守氨基酸序列P-loop和疏水氨基酸GLPL保守序列設計簡并引物，從香蕉抗枯萎病(4號小種)材料基因組中擴增，獲得了4個抗病基因類似物(RGAS)，并發現均與已報道的植物抗病基因有不同程度的同源性。袁克華等(2009，中國農學通報25(05)：271-274)根據R基因結構域的保守序列設計引物，以外源水楊酸誘導的香蕉為材料，在香蕉的基因組中擴增，獲得了與植物抗病基因同源的序列BRGA1，并發現BRGA1在香蕉中受水楊酸調控，屬誘導型表達。曾蕊等(2014，華中農業大學學報33(2)：61-64)利用香蕉組培苗人工接種試驗研究香蕉被枯萎病菌4號小種侵染后防御酶活性的變化規律，發現苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)這四種酶都積極參與了香蕉苗體內的抗病反應。李赤等(2010，中國農學通報26(17)：251-255)研究抗感香蕉品種在接種香蕉枯萎病菌后防御酶系的變化，PAL酶、β-1，3-葡聚糖酶和外切幾丁質酶可以作為香蕉品種抗枯萎病一個重要的生物化學標。王卓等(2013，中國農學通報29(34)：115-121)通過隨機克隆測序的方法從香蕉根系cDNA文庫中獲得1個過氧化物酶基因，命名為MaPOD1。當受到枯萎病侵染時，耐病品種中該基因的表達高于感病品種，可以作為一個新的響應枯萎病侵染的標記基因。香蕉的抗病機理是一個復雜的過程，涉及的相關基因很多。謝江輝等(2008)等公開了兩對引物，主要應用于“威廉斯”香蕉的芽變植株的抗病性鑒定。香蕉的枯萎病抗病機理較為復雜，抗病相關的基因較多，目前能夠直接有效的用于香蕉育種中分子手段還比較少，因此急需對香蕉抗病機理進行多方面研究，開發多種抗枯萎病香蕉的鑒定方法，這方面的研究對香蕉的抗病育種具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術的目的之一在于提供一種鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標記、分子標記引物、試劑盒以及鑒定香蕉枯萎病抗性的方法。本專利技術的目的之二在于提供一種鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標記、分子標記引物以及試劑盒在鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選能夠抗枯萎病的香蕉中的應用。為實現上述目的，本專利技術提供一種鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標記，其特征在于：所述SCAR分子標記具有如SEQID：4所示的296bp核苷酸序列。具體地，所述SCAR分子標記來源于如SEQID：1所示的SRAP分子標記。具體地，所述SCAR分子標記具有296bp的特異性條帶，所述特異性條帶的核苷酸序列如SEQID：4所示。該SCAR分子標記擴增出的目的條帶為單條帶，條帶穩定性好，重現性高，分析簡單快速，且其核苷酸序列較短，PCR擴增所需時間更少，操作更加簡單，可更快速、更高效地實現對香蕉枯萎病抗性的鑒定。本專利技術還提供一種用于擴增上述所述分子標記的引物。具體地，所述引物的核苷酸序列如SEQID：2和SEQID：3所示，利用該引物對可擴增獲得如SEQID：4所示的核苷酸序列。本專利技術還提供一種鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選抗枯萎病的香蕉的試劑盒，所述試劑盒包括上述所述的引物。具體地，所述試劑盒除包含上述引物外，還包括10×PCRbuffer(含Mg2+)，dNTPs及TaqDNA聚合酶。更具體地，所述試劑盒包括10×PCRbuffer(含Mg2+)1mL，SCA11(10μM)300μl，SCA12(10μM)300μl，dNTPs(2.5nM)600μl，TaqDNA(5U/μl)100μl以及ddH2O5mL。本專利技術還提供一種所述引物在制備鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選抗枯萎病的香蕉的試劑盒中的應用。以及，所述分子標記、所述引物、或所述試劑盒在鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選抗枯萎病的香蕉中的應用。具體地，所述香蕉為香牙蕉。本專利技術還提供一種鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選抗枯萎病的香蕉的方法，所述方法包含以下步驟：(1)提取香蕉葉片DNA；(2)以香蕉葉片DNA為模板，用所述引物進行PCR擴增反應；(3)檢測擴增產物，具體表現為檢測296bp特異性條帶的有無。此鑒定方法只需提取香蕉葉片DNA即可對香蕉枯萎病進行鑒定，包括香蕉吸芽苗與組培苗，可實現在任何生長期對香蕉枯萎病抗性的鑒定。具體地，若檢測到所述的296bp的特異性條帶，則香蕉枯萎病抗性為感病，若未檢測到所述的296bp的特異性條帶，則香蕉枯萎病抗性為抗病。具體地，所述的鑒定香蕉枯萎病抗性的方法，所述PCR擴增反應體系包括，PCRbuffer、dNTPs、SCAR特異性引物SCA11/SCA12、DNA及TaqDNA聚合酶。較佳地，在步驟(2)中，所述PCR擴增反應為20μl體系，10×PCRbuffer(含Mg2+)2μl，dNTPs(2.5nM)2μl，SCAR特異性引物SCA11/SCA12(10μM)分別1μl，DNA(50ng/L)1μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.3μl及滅菌的ddH2O12.7μl；所述PCR擴增反應程序為，94℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循環35次，72℃延伸10min。具體地，所述檢測擴增產物的方法為在1.2％的瓊脂糖凝膠，110v電壓電泳25分鐘，在凝膠成像儀觀察照相，若檢測到所述的296bp的特異性條帶，則香蕉枯萎病抗性為感病，若未檢測到所述的296bp的特異性條帶，則香蕉枯萎病抗性為抗病。本專利技術提供的鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標記解決了現有技術中香蕉枯萎病傳統盆栽接種鑒定、水培接種鑒定與病地種植鑒定的局限性本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標記，其特征在于：所述SCAR分子標記具有如SEQ?ID：4所示的296bp的核苷酸序列。

【技術特征摘要】
2017.10.17 CN 20171096300961.一種鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標記，其特征在于：所述SCAR分子標記具有如SEQID：4所示的296bp的核苷酸序列。2.如權利要求1所述的鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標記，其特征在于：所述SCAR分子標記來源于如SEQID：1所示的SRAP分子標記。3.一種用于擴增如權利要求1所述SCAR分子標記的引物。4.如權利要求3所述的引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列如SEQID：2和SEQID：3所示。5.一種鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選抗枯萎病的香蕉的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括如權利要求3～4任一項所述的引物。6.如權利要求3～4任一項所述引物在制備鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選抗枯萎病的香蕉的試劑盒中的應用。7.如權利要求1～2任一項所述分子標記、如權利要求3～4任一項所述引物、或如權利要求5所述試劑盒在鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選抗枯萎病的香蕉中的應用。8.如權利要求6或7所述的應用，其特征在于：所述香蕉為香牙蕉。9.一種鑒定香蕉枯萎病抗性或篩選抗枯萎病的香蕉的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王芳，夏玲，呂順，胡貝，曾莉莎，劉建平，
申請(專利權)人：東莞市香蕉蔬菜研究所，
類型：發明
國別省市：廣東,44