本發明專利技術公開了一種編碼阿爾法一海螺毒素肽（Ｖｃｌ．１）的基因及其利用方法。屬于生物領域。Ｖｃｌ．１是具有２對二硫鍵的１６肽，本發明專利技術公開了編碼這種肽的基因及其基因工程。該基因的利用方法包括將其重組入表達載體，轉化宿主細胞后在其中克隆并表達融合蛋白，經親和層析、復性并純化，獲得具有拮抗神經元型煙堿樣乙酰膽堿受體活性的Ｖｃｌ．１肽。上述方法具有步驟少、質量穩定、產物純度高、制備成本低、副產物少以及不污染環境等優點。所制備的Ｖｃｌ．１在受體研究和藥物開發中也具有重要價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及多肽化合物阿爾法一海螺毒素肽Vc1.1的基因工程及其在制藥中的應用，屬于生物領域。
技術介紹
臨床中使用嗎啡等藥物來緩解癌痛、神經痛等頑固性疼痛會造成耐受、藥效短暫以及成癮等狀況，因此具有很大的局限性。自第一個鎮痛效果強于嗎啡1000倍的鎮痛藥物Ziconotide成功上市以來，其有效成分歐米加海螺毒素MV II A受到了生物醫藥界的極大關注。除此之外，有數種其它的海螺毒素也具有不成癮、低耐受的鎮痛效果。例如阿爾法—海螺毒素Vc1.1，它是一個由十六個氨基酸組成的多肽，具有拮抗神經元型煙堿樣乙酰膽堿受體(nAChr)的活性。該受體與痛覺的傳導相關，抑制該受體可以起到鎮痛作用，且在神經細胞受到傷害后，能夠加速神經損傷的恢復。與MV II A比較起來，Vc1.1具有如下特點(1)鎮痛效果強；(2)鎮痛持續時間長久；(3)給藥方便海螺毒素MVIIA的藥靶位于中樞神經系統，因此需顱內給藥或椎管注射，這大大限制了其使用，而Vc1.1可通過皮下注射、靜脈注射、肌肉注射和腹腔注射等發揮其鎮痛效果，這是由于Vc1.1的所作用的神經元型nAChr位于外周神經系統；(4)低耐受性，無成癮性；(5)副作用小這是由于Vc1.1藥靶確切、作用位點專一、用量低；(6)用途廣泛適用于所有的阿片類藥敏感型和不敏感型的疼痛，特別是癌痛、艾滋病痛、神經痛、糖尿病相關疼痛以及風濕引起的疼痛等。由于天然Vc1.1的產量極少，工業化生產必須通過化學合成或基因工程方法來制備。化學合成反應步驟多、副產物多、純化技術復雜，對環境污染大、對車間工人的健康不利，因此具有較高的制造成本。盡管采用基因工程方法可以克服化學合成的許多缺點，但目前在工藝上實現起來仍面臨許多挑戰(1)Vc1.1是16個氨基酸的小肽，分子量僅1.7kD左右，在復性或純化的過程中，均沒有針對此截留分子量的透析袋或超濾膜供選擇；(2)沒有簡便易行的方法對其進行鑒定和檢測由于分子量小，在SDS-PAGE電泳中很難聚集成一條窄帶，即使Tricine電泳也并非每次都能成功，此外，小分子量區的蛋白Marker難以購買且價格昂貴；(3)Vc1.1是富含二硫鍵的肽，這使其復性更加困難，而目前可供選擇的復性方法中必須用到低截留分子量的透析袋或超濾膜，由前所述，這難以實現；(4)由于分子量小，誘導表達中很容易被細菌胞內蛋白酶降解，難以單獨表達，因此必須考慮串聯表達或融合表達，這些方法都需切割表達產物以獲得目標分子。目前基因工程中用于切割蛋白的主要途徑有溴化氰裂解或凝血酶切割等溴化氰專一地裂解蛋白質中甲硫氨酸處的肽鍵，但試劑本身有劇毒，在制藥工業使用上受到嚴格的限制，且下一步還需要花費較高的成本來去除溴化氰；凝血酶價格較貴、酶切特異性差且容易變性失活。可能由于存在上述技術瓶頸，目前未見基因工程法制備Vc1.1或與其類似的富含二硫鍵的小肽化合物的報道。
技術實現思路
技術問題本專利技術的目的是針對生產上述鎮痛藥物的現有技術基礎及其局限性，公開一種適用于本方法的Vc1.1基因及其應用。這種基因工程工藝使得從菌體裂解物中制備純度95％以上的Vc1.1僅需吸附、復性、酶切、洗脫這4個主要步驟即可，因此在大規模生產和臨床應用具有很強的競爭力。技術方案一種編碼阿爾法一海螺毒素肽Vc1.1的基因，其特征是，該基因的編碼鏈具有如下的核苷酸序列5’GGTTGCTGCTCTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCTAA3’。根據大腸桿菌密碼子的偏好性，設計能夠以正確的讀碼框插入pET-32a(+)載體KpnI和EcoRI限制性酶切位點之間的核苷酸序列ggtaccgac gac gac gac aagGGTTGCTGCTCTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCtaagaattc(順序為5’到3’)。其中，下劃線部分為限制性酶切位點，斜體部分為腸激酶酶切位點，大寫字母部分為編碼區。這樣設計使得Vc1.1基因編碼區能夠以正確的讀碼框插入腸激酶位點和EcoRI酶切位點之間。合成上述序列的雙鏈，并制造KpnI和EcoRI的粘性末端，按照分子克隆中常規的雙酶切技術，將所得核苷酸序列整合入pET-32a(+)載體KpnI和EcoRI限制性酶切位點之間。測序驗證讀碼框正確性和插入的正確性，從而獲得重組載體pET-32-Vc1.1。上述幾個步驟示于圖1。將重組載體轉化入大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)(購于天為時代公司)，獲得重組基因工程菌株EBVc1.1。在T7強啟動子的開啟表達作用下，經過低溫24h誘導后，表達的Trx-Vc1.1融合蛋白(硫氧還原蛋白-Vc1.1融合蛋白)可占菌體總蛋白的50％以上。破碎菌體后，立即將該融合蛋白結合到Ni2+親和層析柱(Ni-NTA或Ni-IDA)上，隨后用空氣飽和的復性緩沖液(20mM Tris-HCl；0.5M精氨酸；50mM NaCl；pH8.0)洗滌浸泡24h，用腸激酶酶切緩沖液(20mM Tris-HCl；2mM CaCl2；50mM NaCl；pH7.4)洗滌浸泡12h以上，按照每單位腸激酶切割5mg融合蛋白的用量將酶加入柱內，室溫反應24h進行充分酶切，期間循環流動酶切緩沖液讓其混勻，待柱子的顏色從淡藍色變為白色或米黃色之后，洗脫即可獲得具生物活性的Vc1.1。最后還可以對產物C末端用絲氨酸型羧肽酶進行酰胺化從而獲得更高活性和更強穩定性的Vc1.1。上述的基因在制備鎮痛藥物中的應用醋酸扭體實驗證明，采用本專利技術中的方法制得的Vc1.1具有與天然Vc1.1同樣的生物活性在腹腔注射0.1μM濃度的肽溶液0.5mL/20gbw的藥物后，在1h、4h和16h時刻均具有于天然Vc1.1類似的顯著鎮痛活性(圖3)。且鎮痛效果以及作用時間均顯著強于已經上市的藥品Ziconotide(MVIIA)。除Vc1.1以外，本系統適合于各種具有鎮痛活性的海螺毒素肽的制備，包括各種阿爾法類或歐米加類海螺毒素。同時，本系統也有助于各類富含二硫鍵的肽的制備。有益效果基因工程中的克隆、誘導表達和破碎菌體并不是本專利技術所要解決的核心問題。重點部分在于創造了一種具有6個組氨酸結構的融合蛋白，該蛋白的結構用“Trx-6His--EK-Vc1.1”式表示。其中，EK為腸激酶酶切位點，而為防止6His吸附位點與Vc1.1距離太近而影響復性，在EK與6His間還存在pET-32a(+)載體本身表達的柔性序列，用在上述結構示意式中用“--”表示。6His與Ni-NTA或Ni-IDA樹脂具有很強的吸附作用，同時這種樹脂具有相當大的載量，使得表達的融合蛋白能牢固地、大量地結合在柱上。經柱上復性和腸激酶酶切之后，具有正確構象的Vc1.1分子被洗脫，而Trx蛋白則以“Trx-6His--EK-”的形式仍吸附在層析柱上，這樣的過程很方便地實現了目標蛋白的復性以及融合蛋白中目標蛋白與非目標蛋白的分離。隨后，用250mM的咪唑將“Trx-6His--EK-”洗脫后，該層析柱還可以繼續使用。經實驗證實，Ni-NTA經洗滌和再生可以反復使用500次以上。這種首創的將6His結構置于兩個組分之間的融合蛋白構建方式在表達、復性并純化這類富含二硫鍵的鎮痛小肽上具有以下突出優點本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種編碼阿爾法一海螺毒素肽Ｖｃ１．１的基因，其特征是，該基因的編碼鏈具有如下的核苷酸序列：５’ＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＡＣＴＡＣＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＡＴＣＴＧＣＴＡＡ３’，該基因編碼阿爾法一海螺毒素 肽Ｖｃｌ．１，其氨基酸序列為：ＧＣＣＳＤＰＲＤＮＹＤＨＰＥＩＣ。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊侖，張治國，連桂芳，徐朗萊，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：84[中國|南京]
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