用于DNA介導基因沉默的組合物制造技術

提供了通過ＲＮＡ干擾介導基因沉默的ＤＮＡ組合物。ＤＮＡ組合物包括驅動編碼中間體小干擾ＲＮＡ分子的核苷酸序列表達的ＲＮＡ聚合酶Ⅲ啟動子和ＲＮＡ聚合酶Ⅲ終止子。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
技術介紹
專利
本專利技術總體上涉及轉錄后基因沉默，特別是涉及DNA介導的通過RNA干擾進行的轉錄后基因沉默。背景信息去除一個基因的表達可以提供給研究者有關該基因功能的信息。在蛋白水平這可以通過運用特異性抑制劑抑制蛋白質功能而實現或者在RNA水平通過阻止mRNA翻譯成蛋白質來完成。用于RNA水平抑制的傳統方法包括反義寡核苷酸和核酶。這些抑制基因表達的方法也提供了對人類疾病的潛在治療方法。新近在mRNA水平沉默基因表達的方法，稱為RNA干擾或RNAi，已經成為較以前的技術而言非常有力的備選方法。它通過大量未知然而卻比反義機制更加有效的機制起作用。雙鏈RNA(“dsRNA”)參與這種轉錄后基因沉默，轉錄后基因沉默在植物和真菌中是天然存在的現象(Cogoni和Macino，Curr.Opin.Microbiol.6657-62.1999)。當導入蠕蟲、蒼蠅、或早期小鼠胚胎時，dsRNA可誘導降解與dsRNA的一條鏈具相同序列的mRNA的細胞反應(Fire，Trends Genet.9358-363，1999)。在一些系統中，少量dsRNA拷貝能誘導靶mRNA全面降解(Fire等，Nature 6669806-811，1998)。RNAi可與mRNA中幾乎任何序列非常成功高效地作用(Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 179742-9747，2001)。RNAi作為基因功能研究工具非常有前途，如果能夠將其成功地用于哺乳動物細胞或有機體，RNAi則是人類疾病的潛在治療方式。RNAi在大多數哺乳動物系統中基本上是不成功的，這一狀況直到最近由于與用于蠕蟲和果蠅的dsRNA相似的dsRNA的導入，通過有PKR和干擾素參與的哺乳動物抗病毒系統誘導了基因表達的普遍阻斷而得以改變(Caplen等，Gene 1-295-105.2000；Oates等，Devel.Biol.120-8.2000)。然而，通過使用一個短的21到23個核苷酸的dsRNA，Elbashir等和其他研究者的研究表明小的干擾RNA(siRNA)能夠降低或敲低(knock-down)特異基因的表達，而不至于引起基因表達的普遍關閉(Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 179742-7.2001；Elbashir等，Nature 6836494-8.2001)。聚合酶III啟動子的使用能夠有效地在哺乳動物細胞內產生siRNA。例如，象U6啟動子一樣，同樣是聚合酶III的III類啟動子的H 1-RNA啟動子已用于質粒載體中，以直接轉錄出一短的發夾RNA，隨后該發夾RNA在細胞內被加工產生siRNA(Brummelkamp等，Science 296550-553.2002)。同樣U6啟動子也用于產生短的發夾RNA(Paddison等，Genes Devel.8948-958.2002；Paul等，Nat.Biotechnol.5505-508.2002；Sui等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85515-20.2002；Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-6052.2002)，或有意和反義siRNAs(Lee等，Nat.Biotechnol.5500-505，2002；Miyagishi和Taira，Nat.Biotechnol.5497-500，2002；Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-52，2002)。短的發夾RNAs(shRNAs)能夠模擬天然存在的可能與RNAi相關的小RNA(micro-RNAs；miRNAs)。然而，當前有關設計和將此類人工shRNA加工成RNAi誘導者功能的資料仍然相互矛盾。例如，一篇報道發現發夾環的大小(如多于7個核苷酸)和序列非常重要(Brummelkamp等，見上文，2002)，而其他人采用較短的環(1，4或6個核苷酸)也成功了(Paddison等，見上文，2002；Paul等，見上文，2002；Sui等，見上文，2002；Yu等，見上文，2002)?；虺聊男谝恍┣闆r下依賴于發夾中有意鏈和反義鏈的次序和方向(Paddison等，見上文，2002)，但是在其他人看來是不重要的或不相干的(Paul等，見上文，2002)(Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-52.2002)。所有上述的研究都利用了短的III類聚合酶III啟動子和其簡單的終止子產生了高拷貝數量的短轉錄物。盡管觀察到了具有誘導非特異性表達關閉潛能的較長轉錄本，簡單的天然終止子可能不足以在預期位置終止所有轉錄(Lee等，見上文，2002)。在用水動力學轉染方法將合成的siRNA或從U6啟動子轉錄的shRNA導入成年小鼠內后能夠有效地使轉基因或病毒基因沉默(McCaffrey等，Nature 41838-39，2002)。將長的或短的通過體外或體內轉錄分離的、在可溶性細胞提取物中加工得到的或化學合成的dsRNA分子導入細胞的方法具有嚴重的局限性。一個局限是分離的dsRNA所介導的基因沉默，也稱作基因敲低，只是暫時的，因為由RNA分子所攜帶的遺傳信息不能整合到宿主細胞的染色體上，所以dsRNA的效應只在有限次的細胞分裂過程中維持。另一個局限是RNA分子特別不穩定，易于被環境中大量存在的RNase降解。因此操作RNA分子需要格外小心。將RNA分子用于治療目的是不切實際的。經修飾的RNA，如在核苷酸上加入保護基團或改變多核苷酸鏈的骨架能夠提高穩定性，就象在許多反義研究中那樣。然而，經修飾RNA分子的幾種形式雖然較天然RNA相比能夠對RNase的降解作用具有更強的抵抗性但會出現RNAi能力的減弱或丟失，而用DNA替換dsRNA中的一條鏈根本不能誘導產生RNAi(Parish等，Mol.Cell 51077-87.2000)。此外，制備RNA分子的費用很高并且方法繁瑣而復雜。由于存在這些局限性，能夠提供永久的導入細胞或生物體(如哺乳動物，例如小鼠或人)，和/或不依賴于使用RNA分子作為載體的用于基因沉默的材料和方法具有巨大的經濟利益。另一方面，DNA分子比RNA分子更加穩定且成本效率更高。DNA分子可以被整合到宿主細胞基因組并且在宿主細胞內具有長期的效應。DNA分子相對容易合成和操作。專利技術概述本專利技術提供了用于靶基因表達抑制和利用DNA作為工具降解靶RNA的方法和組合物。這種方法是指“DNA介導的基因沉默”(“DMSG”“De-message”)。這樣，本專利技術提供了通過對靶細胞(例如，預對其中特定RNA進行降解的細胞)用RNA干擾效應進行的諸如真核細胞或生物體內(包括哺乳動物細胞或有機體在內)基因特異的干擾。本專利技術提供了不必要在靶細胞外操作RNA分子而實現RNAi的好處。可以誘導RNAi用于短暫的基因敲低，還可以用于永久的基因敲低，因為編碼RNAi的DNA分子可以插入到靶細胞內的染色體上。相應的，DMSG也可以用于產生遺傳學上修飾的動物，它是通過將DMSG摻入生殖系統，從而能夠提供根據設計組成型表達或使用誘導試劑誘導表達編碼RNAi的下一代動物。這樣，本專利技術的另一個優點是基因特異的沉默可以限定在一種或少數幾本文檔來自技高網...

【技術保護點】
分離的脫氧核糖核酸（ＤＮＡ）分子，其包含編碼中間體小干擾核糖核酸（ＲＮＡ）分子（ｓｉＲＮＡ）的至少約１６個核苷酸的可表達模板核苷酸序列，所述分離的ＤＮＡ分子介導靶ＲＮＡ的ＲＮＡ干擾，所述中間體ｓｉＲＮＡ包含：ａ）含有與靶ＲＮＡ有意鏈 互補的至少約１５個核苷酸的５′部分和含有不與靶ＲＮＡ有意鏈互補的約１－５個核苷酸的３’端部分，其中該ｓｉＲＮＡ選擇性地與靶ＲＮＡ有意鏈雜交；或ｂ）含有與靶ＲＮＡ反義鏈互補的至少約１５個核苷酸的５’部分和含有不與靶ＲＮＡ反義鏈互補的約 １－５個核苷酸的３’端部分，其中該ｓｉＲＮＡ選擇性地與靶ＲＮＡ反義鏈雜交。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王繼武，
申請(專利權)人：美國綠陽生物技術及醫藥公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]