皺紋盤鮑超氧化物歧化酶及其制備方法和應用技術

本發明專利技術涉及一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶及其制備方法和應用。本發明專利技術公開了一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶基因，含有SEQ?ID?NO.1所述的堿基序列或含有編碼如下蛋白質(a)或(b)的基因：(a)由SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。同時公開了該基因所編碼的蛋白質和重組載體，以及所述超氧化物歧化酶的制備方法。本發明專利技術借助基因工程技術，獲得了超氧化物歧化酶，該蛋白具有很強的清除超氧陰離子自由基、羥自由基、安全性和損傷修復等活性，將在食品添加劑、藥物制備和化妝品等領域中發揮應用價值。

Superoxide dismutase of abalone Haliotis discus ino and preparation method and application thereof

The present invention relates to a wrinkled abalone superoxide dismutase and a preparation method and application thereof. The invention discloses an abalone superoxide dismutase gene containing the SEQ sequence ID NO.1 the following encoding or containing protein (a) or (b) gene (a) consisting of amino acid sequences shown by SEQ ID NO.2 protein (b) in; (a) the amino acid sequence determined through substitution, deletion or addition of one or several amino acids and the activity of superoxide dismutase (a) protein derived from. Also disclosed are proteins encoded by the gene and recombinant vectors, and a process for the preparation of the superoxide dismutase. The present invention by genetic engineering technology, the superoxide dismutase, the protein has strong scavenging superoxide anion radicals, hydroxyl radicals, safety and injury repair activity, will play the application in the field of food additives, pharmaceutical preparation and cosmetics etc..

【技術實現步驟摘要】
皺紋盤鮑超氧化物歧化酶及其制備方法和應用
本專利技術涉及酶及其編碼的基因與應用，特別涉及一種皺紋盤鮑的基因工程表達，具體涉及一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶HdhCu/ZnSOD及其制備方法和應用。
技術介紹
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)是一類廣泛存在動植物以及微生物體內的酸性金屬酶。根據不同的金屬輔基又可分為銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、鐵超氧化物歧化酶(FeSOD)和鎳超氧化物歧化酶(NiSOD)。其在體內的作用是清除外源性和內源性物質引起的自由基、抑制脂質過氧化和延緩機體衰老等，起到保護生物體的效果。能催化H2O2形成水和氧氣，表現出一定的抗氧化能力來清除羥氧自由基等活性氧。其具有一定的清除體內自由基的能力，可作為添加劑、營養強化劑以及保鮮劑等用途應用于化妝品、食品、醫藥等行業。皺紋盤鮑(H.discushannaiIno)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鮑科(Haliotidae)，以其豐富的營養價值在民間一直被認為是與魚翅、燕窩齊名的營養食品。目前，已有的對鮑藥用及食用價值的研究主要集中在多肽與多糖的提取制備及其生物活性研究。海洋生物因其特殊的生活環境和代謝方式，體內存在許多具有藥用價值的特殊生理活性物質，是開發新型海洋藥物和功能食品的重要資源。福建省皺紋盤鮑資源豐富、產量大，至2013年，鮑產量達到88470t，所占比例超過全國產量的80％。鮑產業已成為福建省海水養殖的支柱產業之一，也是水產業增長速度最快、經濟效益最好的產業。如何充分高效地利用鮑資源，挖掘其中的生物活性物質往保健食品和海洋藥物方向高值化利用，符合我省和我國當今新興的海洋戰略發展研究。由于生物體內天然SOD含量極低，直接分離提取工藝相對復雜；而化學合成成本過高且難以保持其天然結構。基因工程以及蛋白質工程的應用為獲得天然活性肽開辟了有效途徑。基因工程制備生物活性肽克服了直接從動、植物原料中提取抗氧化肽篩選水解酶類的盲目性，純化工藝簡單，便于規模化生產，具有很好的產業化前景。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供皺紋盤鮑超氧化物歧化酶HdhCu/ZnSOD的制備方法以其在制備食品添加劑和化妝品等領域的應用。具體而言，本專利技術提供了如下技術方案：一方面，本專利技術提供了一種編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因，含有SEQIDNO.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。優選的，用于所述基因擴增的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本專利技術還提供了一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶，含有以上所述的編碼超氧化物歧化酶的基因所編碼。本專利技術也提供了一種表達皺紋盤鮑超氧化物歧化酶基因的載體，所述載體為含有權利要求1所述的超氧化物歧化酶基因、AOX1啟動子和終止子序列、多克隆位點以及篩選標志的畢赤酵母表達載體，所述畢赤酵母表達載體優選為pPIC9K。優選的，以上所述的載體中，所述超氧化物歧化酶基因位于畢赤酵母表達載體pPIC9K的多克隆位點處EcoRⅠ和NotⅠ限制性內切酶酶切位點之間。優選的，以上所述的載體中，所述篩選標志為6×His-tag標簽。本專利技術同時還提供了一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的制備方法，包括以下步驟：(1)構建含有編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因的重組表達載體；(2)將步驟(1)所得重組表達載體導入宿主細胞，并將宿主細胞進行誘導表達，獲得可表達皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因工程菌菌株；(3)發酵培養已得到的基因工程菌菌株并進行誘導表達，獲得表達產物；(4)分離純化步驟(3)所得的表達產物，獲得重組蛋白，皺紋盤鮑超氧化物歧化酶；其中，步驟(1)中所述編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因，含有SEQIDNO.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。優選的，以上所述的制備方法中，步驟(1)中，所述表達載體為畢赤酵母表達載體，優選為pPIC9K。優選的，以上所述的制備方法中，步驟(2)中，所述宿主細胞為畢赤酵母GS115菌株。優選的，以上所述的制備方法中，步驟(3)中，所述分離純化為先將表達產物進行離心，收集發酵上清液，透析后，再進行親和層析。優選的，以上所述的制備方法中，步驟(4)中，所述分離純化為親和層析法純化。本專利技術另外還提供了以上所述的皺紋盤鮑超氧化物歧化酶在食品添加劑、藥物制備領域或者化妝品領域中的應用。優選的，根據以上所述的應用，所述食品添加劑為動物飼料添加劑，所述皺紋盤鮑超氧化物歧化酶和動物血液的溶血率小于6％。優選的，根據以上所述的應用，所述皺紋盤鮑超氧化物歧化酶相對于PBS溶液，對于正常細胞的存活率維持在80％-110％之間。優選的，根據以上所述的應用，所述皺紋盤鮑超氧化物歧化酶能夠保護和修復過氧化氫引起的細胞損傷。本專利技術所取得的有益效果是：本專利技術借助基因工程技術，利用pPIC9K畢赤酵母表達載體，成功高效得在體外表達了可溶的、易純化分離的、具有抗氧化活性的皺紋盤鮑HdhCu/ZnSOD，該重組蛋白具有很強的清除超氧陰離子自由基、羥自由基等活性。皺紋盤鮑HdhCu/ZnSOD的基因工程表達產品將在制備食品添加劑和化妝品等領域中發揮其應用價值。附圖說明圖1為PCR擴增HdhCu/ZnSOD目的基因片段。M為DNAMarkerDL2000，其中標號1為HdhCu/ZnSOD基因PCR產物，bp為堿基。圖2為SDS-PAGE電泳分析pPIC9K-HdhCu/ZnSOD重組載體轉化畢赤酵母GS115菌株后，HdhCu/ZnSOD蛋白的誘導表達圖，其中M為預染蛋白Marker26616，標號1-7為重組表達載體pPIC9K-HdhCu/ZnSOD轉化畢赤酵母后，甲醇誘導0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h蛋白表達產物。圖3為SDS-PAGE電泳分析不同甲醇濃度誘導下HdhCu/ZnSOD蛋白的表達圖，其中M為預染蛋白Marker26616，標號1-4分別為0.5％體積、1％體積、2％體積、3％體積甲醇濃度誘導下HdhCu/ZnSOD蛋白的表達條帶。圖4為不同PH條件下HdhCu/ZnSOD的表達圖，其中M為預染蛋白Marker26616，標號1-5分別PH為4，5，6，7，8時HdhCu/ZnSOD蛋白的表達條帶。圖5為SDS-PAGE電泳分析純化前后HdhCu/ZnSOD的表達圖，其中M為預染蛋白Marker26616，標號1-4分別為純化前HdhCu/ZnSOD蛋白的表達條帶，標號5-8為純化后HdhCu/ZnSOD蛋白的表達條帶。圖6為HdhCu/ZnSOD蛋白在不同體積分數的Cu離子濃度下的酶活圖。圖7為HdhCu/ZnSOD蛋白在不同溫本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因，其特征在于，含有SEQ?ID?NO.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(a)或(b)的基因：(a)由SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。

【技術特征摘要】
1.一種編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因，其特征在于，含有SEQIDNO.1所述的堿基序列或者含有編碼如下蛋白質(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。2.根據權利要求1所述的基因，其特征在于，用于所述基因擴增的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。3.一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶，其特征在于，含有權利要求1所述的編碼超氧化物歧化酶的基因所編碼。4.一種表達皺紋盤鮑超氧化物歧化酶基因的載體，其特征在于，所述載體為含有權利要求1所述的超氧化物歧化酶基因、AOX1啟動子和終止子序列、多克隆位點以及篩選標志的畢赤酵母表達載體，所述畢赤酵母表達載體優選為pPIC9K。5.根據權利要求4所述的載體，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因位于畢赤酵母表達載體pPIC9K的多克隆位點處EcoRⅠ和NotⅠ限制性內切酶酶切位點之間。6.根據權利要求4或5所述的載體，其特征在于，所述篩選標志為6×His-tag標簽。7.一種皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)構建含有編碼皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因的重組表達載體；(2)將步驟(1)所得重組表達載體導入宿主細胞，并將宿主細胞進行誘導表達，獲得可表達皺紋盤鮑超氧化物歧化酶的基因工程菌菌株；(3)發酵培養已得到的基因工程菌菌株并...

【專利技術屬性】
技術研發人員：喬琨，劉智禹，方春華，陳貝，潘南，吳婧娜，許旻，蔡水淋，
申請(專利權)人：福建省水產研究所，
類型：發明
國別省市：福建,35