本發明專利技術提供了一種應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，包含以下步驟：(1)小鼠腦蛋白的提取；(2)對步驟(1)所得的蛋白質樣品進行FASP酶解、肽段標記；(3)對步驟(2)標記的蛋白質樣品進行HPLC分離肽段混合物及LC?MS質譜分析；(4)對上步所得的質譜鑒定結果進行生物信息學分析、定量分析，獲取弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質。本發明專利技術提供的iTRAQ結合LCMS/MS技術能快速有效地進行蛋白質組學研究，為研究弓形蟲慢性感染致宿主CNS損傷機制以及發現新的生物標志物提供參考。
【技術實現步驟摘要】
應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法本申請要求了2017年03月17日提交中國專利局的，申請號201710162191.5，專利技術名稱為“應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法”的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本申請中。
本專利技術涉及寄生蟲學領域，具體涉及一種應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法。
技術介紹
弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種機會致病性原蟲，可以引起世界性的人獸共患寄生蟲病。據調查，約30％的世界人口有潛在的弓形蟲感染，其中90％發生弓形蟲腦炎的病人死亡，繼發性癱瘓的比例更高。近年來，弓形蟲慢性感染導致的中樞神經系統(centralnervoussystem,CNS)損傷越發受到廣泛關注，這類病患表現為局部或彌散性的神經損傷，常伴隨精神癥狀和行為失常，如產生類似阿茲海默癥的癥狀表現。全球范圍內，I、II、III型弓形蟲均有感染病患報道，但基因型II型引起的人類弓形蟲病占主導地位。關于弓形蟲的致病性及癥狀已經有了大量的研究，然而關于弓形蟲和宿主CNS具體的相互作用機制大多還僅限于血清學的檢測，具體的致病機制和互作蛋白十分復雜，至今所知甚少。蛋白質組學技術已被廣泛應用到包括寄生蟲在內的許多生物體研究中，但目前寄生蟲的基因圖譜極不完善，因此給蛋白質組的研究帶來了一定困難。同位素標記相對和絕對定量(IsobaricTagsForRelativeAndAbsoluteQuantitation，iTRAQ)技術是美國應用生物系統公司2004年推出的一種體外同位素標記技術。作為一種新型蛋白質組學定量研究技術，iTRAQ技術可以在同一實驗中對4種或8種不同樣本進行蛋白質定量比較，對一個基因組表達的全部蛋白質或者一個復雜混合體系中的所有蛋白質進行精確定量和分析鑒定。目前還未有報道應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法。
技術實現思路
為解決上述問題，本專利技術提供了一種應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法。第一方面，本專利技術提供了一種應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，包含以下步驟：(1)小鼠腦蛋白的提取；(2)對步驟(1)所得的蛋白質樣品進行FASP酶解、肽段標記；(3)對步驟(2)標記的蛋白質樣品進行HPLC分離肽段混合物及LC-MS質譜分析；(3)對上步所得的質譜鑒定結果進行生物信息學分析、定量分析，獲取弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質。優選地，步驟(1)中，小鼠包括昆明鼠、Balb/c鼠、沙鼠中的一種或多種。優選地，步驟(1)中所述小鼠腦蛋白的提取，具體步驟為：分別取感染弓形蟲的小鼠腦及健康SPF小鼠腦，進行RIPA裂解、超聲、離心處理，收集上清液。進一步優選地，所述超聲處理的條件為：20W，工作0.8s，停0.8s，超聲10次后放于冰上冷卻，并重復6次。進一步優選地，所述離心處理的條件為：4℃，12000rpm，離心20min，收集上清液。優選地，步驟(2)中FASP酶切具體包括：a)在對步驟(1)所得的蛋白質樣品定量后，每個樣本取200μg蛋白溶液置于離心管中，加入TCEP還原試劑，60℃反應1h；然后加入MMTS半胱氨酸封閉試劑，室溫反應30分鐘；獲得還原烷基化后的蛋白溶液；b)將還原烷基化后的蛋白溶液加入超濾管中，離心，棄掉收集管底部溶液；加入8M尿素(pH8.5)，離心，棄掉收集管底部溶液；加入0.25MTEAB(pH8.5)，離心，棄掉收集管底部溶液；更換新的收集管，在超濾管中加入0.5MTEAB，加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質量比優選為1:50)，37℃反應過夜；次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質量比優選為1:100)，37℃反應4h，離心獲得酶解消化后的肽段溶液。優選地，步驟(2)肽段標記具體包括：參照AB公司試劑盒iTRAQReagent-8plexMultiplexKit(ABSCIEX)說明書進行FASP酶切后所得肽段的標記。進一步優選地，步驟(2)肽段標記包括：a)取8標iTRAQ試劑盒，平衡至室溫；向每管iTRAQ試劑中加入150μl異丙醇，渦旋振蕩，離心至管底，獲得異丙醇處理后的iTRAQ試劑；b)取50μl樣品(約100μg酶解產物)轉移到新的離心管中，加入步驟a)異丙醇處理后的的iTRAQ試劑到樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應2h；加入水終止反應，獲得標記肽段。優選地，步驟(3)具體包括：a)先用95％的A相5％B相平衡柱子，然后將步驟(2)標記后多肽用A相復溶，進樣后以0.2ml/min的速率進行梯度洗脫：B相從5％到37％，最后在5min內使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min；收取肽段溶液，真空干燥后，進行第二維LC-MS分析；其中，A相：水(NH3inH2O，pH10)；B相：80％乙腈(NH3inH2O，pH10)；b)步驟(a)真空干燥后的肽段用樣品溶解液溶解，充分振蕩渦旋、離心，上清轉移到上樣管中，進行質譜鑒定；色譜柱信息：75umi.d.x150mm,裝填AcclaimPepMapRSLCC18,2μm,nanoViper；流動相A：0.1％甲酸；流動相B：0.1％甲酸，80％CAN(硝酸鈰銨)；流速：300nL/min；每個組分分析時間：65min；有效梯度：B相從5％上升至35％，40min。進一步優選地，步驟(3)具體包括：a)先用95％的A相5％B相平衡柱子(Phenomenexcolumns；Gemini-NX3uC18110A；150*2.00mm)30min，然后將標記后抽干的混合多肽用200μl的A相復溶，取100μl進樣后以0.2ml/min的速率進行梯度洗脫：B相從5％到37％，最后在5min內使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min；整個洗脫過程在214nm吸光度下進行監測，從線性梯度開始根據峰型收取24個組分，每1管每50秒鐘接1次，梯度為85min，反復循環接樣；根據峰型和時間共收取24個組分(肽段)，真空干燥后，進行第二維LC-MS分析；其中，A相：水(NH3inH2O，pH10)；B相：80％乙腈(NH3inH2O，pH10)b)肽段用樣品溶解液(0.1％甲酸、5％乙腈)溶解，充分振蕩渦旋，13500rpm，4℃離心20min，上清轉移到上樣管中，進行質譜鑒定；色譜柱信息：75umi.d.x150mm,裝填AcclaimPepMapRSLCC18,2μm,nanoViper；流動相A：0.1％甲酸；流動相B：0.1％甲酸，80％CAN(硝酸鈰銨)；流速：300nL/min；每個組分分析時間：65min；有效梯度：B相從5％上升至35％，40min；c)分離后的肽段直接進入質譜儀ThermoScientificQExactive進行在線檢測，具體參數如下：一級質譜參數：Resolution：70,000；AGCtarget：3e6；MaximumIT：100ms；Scanrange：350to1800m/z；二級質譜參數：Resolution：17,500；A本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，包含以下步驟：(1)小鼠腦蛋白的提取；(2)對步驟(1)所得的蛋白質樣品進行FASP酶解、肽段標記；(3)對步驟(2)標記的蛋白質樣品進行HPLC分離肽段混合物及LC?MS質譜分析；(4)對上步所得的質譜鑒定結果進行生物信息學分析、定量分析，獲取弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質。
【技術特征摘要】
2017.03.17 CN 20171016219151.一種應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，包含以下步驟：(1)小鼠腦蛋白的提取；(2)對步驟(1)所得的蛋白質樣品進行FASP酶解、肽段標記；(3)對步驟(2)標記的蛋白質樣品進行HPLC分離肽段混合物及LC-MS質譜分析；(4)對上步所得的質譜鑒定結果進行生物信息學分析、定量分析，獲取弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質。2.如權利要求1所述的應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，步驟(1)中，小鼠包括昆明鼠、Balb/c鼠、沙鼠中的一種或多種。3.如權利要求2所述的應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，步驟(3)具體包括：a)平衡柱子，然后將步驟(2)標記后的多肽用A相復溶，進樣后以0.2ml/min的速率進行梯度洗脫：B相從5％到37％，最后在5min內使B相的比例上升至95％并保持5min，共85min；收取肽段溶液，真空干燥后，進行第二維LC-MS分析；其中，A相為pH＝10的氨水，B相為含80％乙腈pH＝10的氨水；b)步驟(a)真空干燥后的肽段用樣品溶解液溶解，充分振蕩渦旋、離心，上清轉移到上樣管中，進行質譜鑒定；色譜柱信息：75umi.d.x150mm,裝填AcclaimPepMapRSLCC18,2μm,nanoViper；流動相A：0.1％甲酸；流動相B：0.1％甲酸，80％CAN(硝酸鈰銨)；流速：300nL/min；每個組分分析時間：65min；有效梯度：B相從5％上升至35％，40min。4.如權利要求1所述的應用iTRAQ技術研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質組的方法，其特征在于，獲取弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異...
【專利技術屬性】
技術研發人員：袁子國，呂琳，王亞培，黃萬意，張秀香，馮偉利，呂淑媚，鄭玉香，周雪，陳雅俊，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：廣東,44
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