蛋白類藥物中唾液酸的檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了蛋白類藥物中唾液酸的檢測(cè)方法。具體地，本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種對(duì)蛋白的唾液酸含量進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述方法包括步驟：(1)提供一待分析樣品，其中含有待分析蛋白；(2)對(duì)步驟(1)中的樣品進(jìn)行酸水解，得到酸水解產(chǎn)物；(3)對(duì)(2)中所述的酸水解產(chǎn)物用標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，獲得經(jīng)標(biāo)記的混合物；(4)用有機(jī)溶劑對(duì)所述經(jīng)標(biāo)記的混合物進(jìn)行色譜預(yù)處理，獲得預(yù)處理的混合物；(5)將所述預(yù)處理的混合物上樣于親水相互作用色譜柱，進(jìn)行色譜分離，獲得含標(biāo)記的唾液酸的洗脫液；(6)對(duì)所述的洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測(cè)定結(jié)果。

Method for detecting sialic acid in protein drugs

The present invention provides a method for detecting sialic acid in a protein drug. Specifically, the present invention provides a protein of the sialic acid content detection method, the method includes the steps of: (1) provide a sample to be analyzed, which contains the protein to be analyzed; (2) to step (1) samples of acid hydrolysis, acid hydrolysis products; (3) on (2) in the acid hydrolysis products of the labeled with labeling reagent, obtained by labeling mixture; (4) with organic solvent, the mixture of labeled chromatography pretreatment, mixture pretreatment; (5) the mixture of the pretreated sample in hydrophilic interaction chromatography column chromatographic separation was obtained with labeled sialic acid eluate; (6) of the eluent were detected, so as to obtain the determination results of sialic acid content of the protein.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
蛋白類藥物中唾液酸的檢測(cè)方法
本專利技術(shù)涉及質(zhì)控檢測(cè)領(lǐng)域，具體地涉及蛋白類藥物中唾液酸的檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
唾液酸(SA)是一類神經(jīng)氨酸的衍生物，一個(gè)含有9個(gè)碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖，系統(tǒng)命名為5-氨基-3,5二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。根據(jù)5號(hào)碳上不同的連接基團(tuán)，構(gòu)成了不同的唾液酸衍生物。最主要的兩種唾液酸為5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-D-半乳壬酮糖(NANA，Neu5Ac，N-乙酰神經(jīng)氨酸)和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)，其余的唾液酸均是由這兩種衍生而成。而N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA)是NANA的乙酰基位置上發(fā)生了羥基化而得到的。NGNA和NANA通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸修飾與蛋白類藥物的安全性及有效性息息相關(guān)，對(duì)唾液酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量監(jiān)測(cè)既能監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，同時(shí)又利于藥物的質(zhì)量控制。目前唾液酸檢測(cè)方法主要分為兩類，第一種參考藥典方法，取適量蛋白樣品，加入一定濃度的硫酸或其他酸性試劑，高溫條件下將唾液酸水解，之后離心取上清采用陰離子交換色譜柱進(jìn)行分離紫外檢測(cè)，進(jìn)行定量。這種方法靈敏度較低，對(duì)于目前的藥物蛋白具有很大的局限性，僅能對(duì)一些唾液酸含量高的融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于唾液酸含量較少的蛋白無法準(zhǔn)確定量，尤其對(duì)于占據(jù)生物藥市場(chǎng)半壁江山的抗體類藥物無法采用該方法進(jìn)行唾液酸準(zhǔn)確定量。第二種方法為采用DMB(4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺二鹽酸鹽)熒光標(biāo)記，采用反相色譜柱，流動(dòng)相選擇ACN/MeOH/H2O9/7/84等度分離，之后激發(fā)波長373nm，發(fā)射波長448nm檢測(cè)外標(biāo)定量。然而，該方法不僅成本高，而且存在以下缺點(diǎn)：1)處理后的樣品含有干擾物質(zhì)(如無法徹底去除蛋白)，會(huì)顯著縮短色譜柱的壽命；(2)即使采用離心方式也無法充分去除蛋白，而采用溶劑處理，則會(huì)在色譜分離時(shí)產(chǎn)生溶劑效應(yīng)；(3)每次樣品分析后需要較長時(shí)間的色譜柱沖洗；(4)標(biāo)記試劑與雜質(zhì)峰可能會(huì)影響唾液酸分離及鑒定，標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間會(huì)發(fā)生漂移，重現(xiàn)性不好，方法的耐受性較差。綜上所述，本領(lǐng)域尚缺乏令人滿意的高準(zhǔn)確性和高靈敏度的對(duì)蛋白類藥物中唾液酸進(jìn)行檢測(cè)的方法。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的、高準(zhǔn)確性和高靈敏度的對(duì)蛋白類藥物中唾液酸進(jìn)行檢測(cè)的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種高準(zhǔn)確性和高靈敏度的對(duì)蛋白類藥物中唾液酸進(jìn)行檢測(cè)的方法。在本專利技術(shù)的第一方面，提供了一種對(duì)蛋白的唾液酸含量進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括步驟：(1)提供一待分析樣品，其中含有待分析蛋白；(2)對(duì)步驟(1)中的樣品進(jìn)行酸水解，得到酸水解產(chǎn)物；(3)對(duì)(2)中所述的酸水解產(chǎn)物用標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，獲得經(jīng)標(biāo)記的混合物；(4)用有機(jī)溶劑對(duì)所述經(jīng)標(biāo)記的混合物進(jìn)行色譜預(yù)處理，獲得預(yù)處理的混合物；(5)將所述預(yù)處理的混合物上樣于親水相互作用色譜柱，進(jìn)行色譜分離，獲得含標(biāo)記的唾液酸的洗脫液；(6)對(duì)所述的洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測(cè)定結(jié)果。在另一優(yōu)選例中，所述方法的唾液酸檢測(cè)信噪比大于3(如3-500，較佳地3-200，更佳地4-50，較佳地5-20)。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(6)中，包括對(duì)將樣品的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線或標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測(cè)定結(jié)果。在另一優(yōu)選例中，所述的樣品體積≥25微升，如25-2000微升，較佳地50-1500微升。在另一優(yōu)選例中，所述的樣品中，蛋白量含量≥50μg，優(yōu)選500μg。在另一優(yōu)選例中，所述方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到10pmol或更低。在另一優(yōu)選例中，對(duì)于10pmol的樣品，唾液酸檢測(cè)信噪比大于3。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(2)之后，步驟(3)之前還包括瞬離步驟。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(4)之后，步驟(5)之前還包括振蕩混勻步驟。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(4)之后，步驟(5)之前還包括離心步驟。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，所述離心步驟為5000-20000rpm離心1-15分鐘，如13000r/min離心5分鐘。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中所述酸水解所用酸選自下組：乙酸、三氟乙酸、硫酸、鹽酸、甲酸、三氯乙酸、磷酸、硝酸。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(2)中所述酸水解中，所用酸的終濃度為1-3M，較佳地為2M。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(2)中酸水解的反應(yīng)條件為65-85℃反應(yīng)1-4小時(shí)，較佳地為70-80℃反應(yīng)1.5-3小時(shí)，更佳地為70-80℃反應(yīng)2小時(shí)，又更佳地為80℃反應(yīng)2小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，所述方法中，步驟(3)中標(biāo)記的反應(yīng)條件為40-60℃避光反應(yīng)1-3小時(shí)，較佳地為40-60℃避光反應(yīng)1.5-2.5小時(shí)，更佳地在約50±2℃避光反應(yīng)2±0.5小時(shí)，又更佳地在50℃避光反應(yīng)2小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，所述待分析蛋白為抗體蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述待分析蛋白為單抗蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述待分析蛋白為融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述標(biāo)記試劑選自：4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺二鹽酸鹽(DMB)，或具有式I結(jié)構(gòu)的標(biāo)記化合物：式中，化合物1，X＝O，R＝CH3；化合物2，X＝O，R＝化合物3，X＝NH，R＝H；化合物4，X＝NH，R＝CH3；化合物5，X＝NH，R＝化合物6，X＝NH，R＝在另一優(yōu)選例中，所述有機(jī)溶劑選自下組：乙腈、甲醇、乙醇、DMSO、異丙醇、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述有機(jī)溶劑(預(yù)處理劑)選自下組：乙腈、含乙腈的混合溶劑。在另一優(yōu)選例中，在預(yù)處理步驟中，有機(jī)溶劑(預(yù)處理劑)的用量為60％-95％(終濃度)，較佳地為80％，按預(yù)處理混合物的總體積計(jì)。在另一優(yōu)選例中，所述分析方法不包括脫鹽步驟。在另一優(yōu)選例中，所述的方法為產(chǎn)品質(zhì)量控制方法。在另一優(yōu)選例中，所述的方法為特性研究方法。在另一優(yōu)選例中，所述的方法為非診斷性和非治療性的方法。在另一優(yōu)選例中，所述色譜柱為BEHamide柱。在另一優(yōu)選例中，所述BEHamide柱為聚糖BEHamide柱，例如WatersGlycanBEHAmide柱。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)流速為0.1-0.8ml/min，較佳地為0.2-0.6ml/min，更佳地為0.4ml/min。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)檢測(cè)波長為ex＝373nmem＝448nm。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)運(yùn)行時(shí)間為8-20分鐘，較佳地為12分鐘。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)進(jìn)樣量為0.2-15μl，較佳地為5μl。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的參數(shù)進(jìn)樣盤溫度為10℃以下，較佳地為4℃。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動(dòng)相包含水相和有機(jī)溶劑。在另一優(yōu)選例中，所述水相中添加有緩沖鹽。在另一優(yōu)選例中，所述水相的起始比例不高于40％，最佳地為15％。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑選自：甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動(dòng)相為水和乙腈。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動(dòng)相為水和甲醇。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動(dòng)相為水和乙醇。在另一優(yōu)選例中，所述色譜分析的流動(dòng)相為水和丙醇。在本專利技術(shù)的第二方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括：(1)酸水解試劑；(2)標(biāo)記試劑；(3)任選的標(biāo)準(zhǔn)品和/或標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)品選自NGNA、NA本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種對(duì)蛋白的唾液酸含量進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于，包括步驟：(1)提供一待分析樣品，其中含有待分析蛋白；(2)對(duì)步驟(1)中的樣品進(jìn)行酸水解，得到酸水解產(chǎn)物；(3)對(duì)(2)中所述的酸水解產(chǎn)物用標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，獲得經(jīng)標(biāo)記的混合物；(4)用有機(jī)溶劑對(duì)所述經(jīng)標(biāo)記的混合物進(jìn)行色譜預(yù)處理，獲得預(yù)處理的混合物；(5)將所述預(yù)處理的混合物上樣于親水相互作用色譜柱，進(jìn)行色譜分離，獲得含標(biāo)記的唾液酸的洗脫液；(6)對(duì)所述的洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測(cè)定結(jié)果。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種對(duì)蛋白的唾液酸含量進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于，包括步驟：(1)提供一待分析樣品，其中含有待分析蛋白；(2)對(duì)步驟(1)中的樣品進(jìn)行酸水解，得到酸水解產(chǎn)物；(3)對(duì)(2)中所述的酸水解產(chǎn)物用標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，獲得經(jīng)標(biāo)記的混合物；(4)用有機(jī)溶劑對(duì)所述經(jīng)標(biāo)記的混合物進(jìn)行色譜預(yù)處理，獲得預(yù)處理的混合物；(5)將所述預(yù)處理的混合物上樣于親水相互作用色譜柱，進(jìn)行色譜分離，獲得含標(biāo)記的唾液酸的洗脫液；(6)對(duì)所述的洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得所述蛋白的唾液酸含量的測(cè)定結(jié)果。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述酸水解所用酸選自下組：乙酸、三氟乙酸、硫酸、鹽酸、甲酸、三氯乙酸、磷酸、硝酸。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待分析蛋白為抗體蛋白。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待分析蛋白為融合蛋白。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記試劑選自：4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺二鹽酸鹽(DMB)，或具有式I結(jié)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：邢偉博，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：信達(dá)生物制藥蘇州有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇,32