定量檢測Lp?PLA2的時間分辨熒光免疫分析試紙條及其制備方法技術

本發明專利技術公開了一種定量檢測Lp?PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條，包括底板以及依次粘覆在底板上相互交錯排列的樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，結合墊上包被有稀土離子微球標記的Lp?PLA2單克隆抗體I和稀土離子微球標記的雞IgY抗體，包被膜上包被有檢測帶和質控帶，檢測帶固定有識別不同抗原表位的Lp?PLA2單克隆抗體II，質控帶固定有羊抗雞IgY抗體。本發明專利技術的試紙條具有操作簡便，適合大規模生產，能夠快速精確的測定Lp?PLA2的含量。

【技術實現步驟摘要】
定量檢測Lp-PLA2的時間分辨熒光免疫分析試紙條及其制備方法
本專利技術涉及醫學檢驗領域，具體涉及一種可定量檢測脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)的時間分辨熒光免疫分析試紙條及其制備方法。
技術介紹
脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)是磷脂酶A2超家族的一個亞類，又稱血小板活化因子乙酰水解酶，分子量45kDa,是一種Ca2+依賴性蛋白質。血液中的Lp-PLA2主要由單核/巨噬細胞、T淋巴細胞和肥大細胞分泌，在動脈粥樣斑塊內的巨噬細胞也能產生Lp-PLA2。血液循環中的約80％的Lp-PLA2黏附在低密度脂蛋白(LDL)上，并且和低密度脂蛋白一起轉運到血管內膜。一小部分Lp-PLA2與高密度脂蛋白(HDL)、超低密度脂蛋白(VLDL)和脂蛋白a[Lp(a)]結合。Lp-PLA2能夠水解氧化低密度脂蛋白，導致動脈粥樣硬化部分產生大量的溶血卵磷脂和游離的氧化脂肪酸等水解產物，后兩者在動脈粥樣硬化斑塊病變發展和壞死核心形成中起到重要作用。引起單核細胞趨化，內皮功能障礙，誘導內皮細胞表達白細胞黏附因子、血小板源性生長因子和表皮生長因子，這些物質可通過趨化炎癥細胞進一步產生自我強化的循環，生成更多促炎物質。冠狀動脈粥樣硬化是最常見的狹窄性冠脈疾病，隨著疾病進展，可能發展為冠心病心絞痛，甚至心肌梗死。血脂異常、炎癥和氧化應激都是動脈粥樣硬化發生和發展的重要機制。近年來多項研究表明，人血漿脂蛋白相關磷脂酶A2通過參與炎癥反應而促進動脈粥樣硬化的發展，是具有血管特異性的炎癥標志物，是動脈粥樣硬化事件發生的危險因子和預測因子。Lp-PLA2是獨立的心血管疾病預測指標，與心腦血管疾病呈線性相關，而且不受其他風險因子的影響，并且Lp-PLA2還可用于對患者發生不良心血管事件的風險進行分層，進而輔助制定治療方案，現有技術對Lp-PLA2進行檢測是通過免疫增強比濁的方法進行，但該方法是通過測量在546nm波長下反應液OD值的變化對Lp-PLA2進行定量，檢測不夠靈敏，且在檢測過程中，當一束光線通過帶有微小粒子的懸浮液和膠體溶液時，溶液受到光散射和光吸收兩個因素影響可使光的強度減弱，減弱的程度與溶液中微小粒子的含量成正比，從而導致線性范圍較窄，同時該方法中使用的鼠抗人脂蛋白相關磷脂酶A2單克隆抗體被標記在致敏乳膠顆粒上，保存于磷酸鹽緩沖液中，液態保存的標記抗體必須長期保存于2-8℃，才能保證其穩定性和檢測結果的準確性，導致存儲不方便；同時校準周期頻繁，操作不便。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種定量檢測脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)的時間分辨免疫分析試紙條及其制備方法，采用該免疫分析試紙條具有操作簡單、方便快捷、結果準確等優點，適合單人份和較小批量檢測用。本專利技術提供的一種定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條，包括底板以及依次粘覆在所述底板上相互交錯排列的樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，所述結合墊上包被有稀土離子微球標記的Lp-PLA2單克隆抗體I和稀土離子微球標記的雞IgY抗體，所述包被膜上包被有檢測帶和質控帶，所述檢測帶固定有識別不同抗原表位的Lp-PLA2單克隆抗體II，所述質控帶固定有羊抗雞IgY抗體。優選的，所述結合墊為聚酯膜。優選的，所述包被膜為硝酸纖維素膜。優選的，所述檢測帶和所述質控帶相互平行，所述檢測帶靠近所述結合墊，所述質控帶靠近所述吸水紙。優選的，所述試紙條還包括一殼體，所述試紙條裝入殼體內，露出樣品墊、結合墊、包被膜上的檢測帶和質控帶、以及吸水墊。優選的，所述稀土離子微球為用于標記的任何鑭系金屬元素微球。優選的，所述稀土離子微球表面帶有活性基團，且所述稀土離子微球的直徑為100-300nm。本專利技術提供定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條的制備方法，包括如下步驟：(1)在包被膜的不同位置分別固定Lp-PLA2單克隆抗體II和羊抗雞IgY抗體，形成檢測帶和質控帶；(2)制備稀土離子微球標記的Lp-PLA2單克隆抗體I和稀土離子微球標記的雞IgY抗體，并噴涂在結合墊上；(3)在底板上依次相互交錯的黏貼上樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，然后裝入殼體。優選的，步驟(1)中，所述包被膜的制備方法為：使用含有1％-10％蔗糖的0.01-0.02mol/L的pH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，分別將Lp-PLA2單克隆抗體II和羊抗雞IgY抗體稀釋到1mg/mL-1.5mg/mL的濃度，使用定量噴膜儀以1μL/cm-2μL/cm的量將二者以0.5cm-1.0cm的間隔噴于包被膜上，35-38℃烘干1-2h，加入干燥劑封存備用。優選的，步驟(2)中，所述稀土離子微球標記的Lp-PLA2單克隆抗體I的制備方法包括為：將Lp-PLA2單克隆抗體I用0.01mol/L-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的磷酸緩沖液在2℃-4℃溫度下透析過夜，之后調整濃度為1mol/L-1.5mol/L；使用0.02mol/L-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的MES活化緩沖液洗滌微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，終濃度為10mmol/L-20mmol/L，室溫反應10-20分鐘，充分洗滌微球，用0.02mol/L-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液復溶后加入透析后的Lp-PLA2單克隆抗體I，使Lp-PLA2單克隆抗體I與微球的質量比為1:50-4:50，室溫反應1-2小時，加入含有1％-10％BSA的0.01-0.05mol/L的pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，室溫反應20-35分鐘，洗滌微球，用含有0.05％-1％BSA，0.05％-0.1％Tween-20，0.01-0.05mol/L的pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液保存液復溶至原體積，使用定量噴膜儀以3μL/cm-5μL/cm噴涂于聚酯膜上，避光，在35-38℃烘干1-2小時，加入干燥劑封存備用；所述稀土離子微球標記的雞IgY抗體制備方法為：將雞IgY抗體用0.01mol/L-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的磷酸緩沖液在2℃-4℃溫度下透析過夜，之后調整濃度為1mol/L-1.5mol/L；使用0.02mol/L-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的MES活化緩沖液洗滌微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，終濃度為10mmol/L-20mmol/L，室溫反應10-20分鐘，充分洗滌微球，用0.02mol/L-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液復溶后加入透析后的雞IgY抗體，使雞IgY抗體與微球的質量比為1:50-4:50，室溫反應1-2小時，加入含有1％-10％BSA的0.01-0.05mol/L的pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，室溫反應20-35分鐘，洗滌微球，用含有0.05％-1％BSA，0.05％-0.1％Tween-20，0.01-0.05mol/L的pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液保存液復溶至原體積，使用定量噴膜儀以3μL/cm-5μL/cm噴涂于聚酯膜上，避光，在35-38℃烘干1-2小時，加入干燥劑封存備用。與現有的免疫增強比濁法相比，時間分辨熒光免疫分析利用了具有獨特熒光特本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種定量檢測脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp?PLA2)時間分辨熒光免疫分析試紙條，包括底板以及依次粘覆在所述底板上相互交錯排列的樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，其特征在于，所述結合墊上包被有稀土離子微球標記的Lp?PLA2單克隆抗體I和稀土離子微球標記的雞IgY抗體，所述包被膜上包被有檢測帶和質控帶，所述檢測帶固定有識別不同抗原表位的Lp?PLA2單克隆抗體II，所述質控帶固定有羊抗雞IgY抗體。

【技術特征摘要】
1.一種定量檢測脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)時間分辨熒光免疫分析試紙條，包括底板以及依次粘覆在所述底板上相互交錯排列的樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，其特征在于，所述結合墊上包被有稀土離子微球標記的Lp-PLA2單克隆抗體I和稀土離子微球標記的雞IgY抗體，所述包被膜上包被有檢測帶和質控帶，所述檢測帶固定有識別不同抗原表位的Lp-PLA2單克隆抗體II，所述質控帶固定有羊抗雞IgY抗體。2.根據權利要求1所述一種定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條，其特征在于，所述結合墊為聚酯膜。3.根據權利要求1所述一種定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條，其特征在于，所述包被膜為硝酸纖維素膜。4.根據權利要求1所述一種定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條，其特征在于，所述檢測帶和所述質控帶相互平行，所述檢測帶靠近所述結合墊，所述質控帶靠近所述吸水紙。5.根據權利要求1所述一種定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條，其特征在于，所述試紙條還包括一殼體，所述試紙條裝入殼體內，露出樣品墊、結合墊、包被膜上的檢測帶和質控帶、以及吸水墊。6.根據權利要求1所述一種定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條，其特征在于，所述稀土離子微球為用于標記的任何鑭系金屬元素微球。7.根據權利要求6所述一種定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條，其特征在于，所述稀土離子微球表面帶有活性基團，且所述稀土離子微球的直徑為100-300nm。8.一種根據權利要求1-7中任一項所述一種定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)、在包被膜的不同位置分別固定Lp-PLA2單克隆抗體II和羊抗雞IgY抗體，形成檢測帶和質控帶；(2)制備稀土離子微球標記的Lp-PLA2單克隆抗體I和稀土離子微球標記的雞IgY抗體，并噴涂在結合墊上；(3)在底板上依次相互交錯的黏貼上樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，然后裝入殼體。9.根據權利要求8所述定量檢測Lp-PLA2時間分辨熒光免疫分析試紙條的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述包被膜的制備方法為：使用含有1％-10％蔗糖的0.01-0.02mol/L的pH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，分別將Lp-PLA2單克隆抗體II和羊抗雞IgY抗體稀釋到1mg/mL-1.5mg/mL的濃度，使用定量噴膜儀以1μL/cm-2μL/cm的量將二者以0.5cm-1.0cm的間隔噴于包被膜上，35-38℃烘干1-2h，加入干燥劑封存備用。1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陶劍，周穎，蘭成杰，高玉蘭，
申請(專利權)人：天津歐爾克醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：天津,12