一種寨卡病毒的可視化檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種寨卡病毒的可視化檢測(cè)方法，該方法包括提取寨卡病毒核酸、采用環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增體系擴(kuò)增寨卡病毒NS5基因的RNA片段和采用含待測(cè)樣品的核酸層析試紙條檢測(cè)的三個(gè)步驟。本發(fā)明專利技術(shù)所述的方法具有特異性好，靈敏度高，快速高效，無污染，能準(zhǔn)確、快速檢測(cè)寨卡病毒的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于寨卡感染以及混合感染寨卡病毒的早期鑒別診斷、疫情防控、檢驗(yàn)檢疫等多個(gè)領(lǐng)域，尤其是寨卡病毒流行爆發(fā)期大樣本量的檢測(cè)。

Visual detection method for stockade card virus

The invention relates to a Zika virus visual detection method, the method includes extracting Zika virus nucleic acid, were amplified with the amplification of Zika virus NS5 gene fragment of RNA loop mediated and three steps including nucleic acid chromatography test sample detection using. The method of the invention has good specificity, high sensitivity, fast and efficient, no pollution, can accurately and quickly detect the advantages of Zika virus, which can be widely used in Zika infection and mixed infection of Zika virus to the early diagnosis, epidemic prevention and control, inspection and quarantine and other fields, especially the detection card village virus epidemic outbreak of large sample.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種寨卡病毒的可視化檢測(cè)方法
本專利技術(shù)涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及包含核酸、酶或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)方法，特別是涉及寨卡病毒的檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
寨卡病毒屬于黃病毒科，黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒，其主要的傳播媒介是埃及伊蚊和白紋伊蚊。1947年首次在烏干達(dá)從恒河猴體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)寨卡病毒，1952年在烏干達(dá)和坦桑尼亞的人體中分離到。2007年以前，世界僅報(bào)告14例ZIKV病散發(fā)病例，2007年首次在太平洋島國密克羅尼西亞的雅普島發(fā)現(xiàn)寨卡病毒暴發(fā)疫情之后，出現(xiàn)ZIKV感染病例和暴發(fā)疫情的國家及地區(qū)增加明顯，已經(jīng)在非洲、東南亞和美洲等地造成多次暴發(fā)流行。2015年5月，巴西報(bào)告首例寨卡病毒感染病例；當(dāng)年10月份，巴西報(bào)告新生兒小頭畸形數(shù)量處于明顯上升，時(shí)空分布與寨卡病毒流行區(qū)相吻合。截至2016年1月2日，巴西衛(wèi)生部官方統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，巴西因寨卡病毒所致的疑似新生兒小頭畸形病例已達(dá)3174例，其中已有38例死亡，2月初該數(shù)字已達(dá)4783例。研究表明，除了引起小頭畸形以外，寨卡病毒感染還和格林-巴利綜合征有也有著密切的聯(lián)系。疫情的快速蔓延以及與小頭畸形之間的可能因果關(guān)系，引起了國際社會(huì)的廣泛關(guān)注。寨卡病毒全基因長度約為11Kb，直徑40～70nm，有包膜，包含10794個(gè)核苷酸，編碼3419個(gè)氨基酸，寨卡病毒基因編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白(C)、膜前體蛋白(prM)和包膜蛋白(M)，以及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。目前，國內(nèi)外對(duì)寨卡病毒的診斷方法，主要還是依靠病毒培養(yǎng)、血清學(xué)試驗(yàn)、常規(guī)的RT-PCR檢測(cè)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其中，血清學(xué)試驗(yàn)、組織培養(yǎng)具有靈敏度低、免疫交叉反應(yīng)以及周期長等缺點(diǎn)；而RT-PCR也存在容易污染、耗時(shí)長的不足，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)因?yàn)槠鋬x器設(shè)備昂貴，不利于一般檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)及大樣本量檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種寨卡病毒的可視化檢測(cè)方法，該方法具有準(zhǔn)確、快速和直觀的優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)解決上述問題的技術(shù)方案如下：一種寨卡病毒的可視化檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：(1)取寨卡病毒，按北京全式金生物科技有限公司生產(chǎn)的EasyPureViralDNA/RNAKit的說明書提取寨卡病毒核酸；(2)以步驟(1)得到的寨卡病毒核酸為模板，采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法(LAMP)擴(kuò)增寨卡病毒NS5基因的RNA片段，獲得核酸擴(kuò)增產(chǎn)物；所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法的引物由一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物組成，其中，所述的一對(duì)外引物為：Zika-F3：5’-TGGGATGTGGTGACTGGA-3’(SEQNO.1)；Zika-B3：5’-TGCATTGCTACGAACCTTGT-3’(SEQNO.2)；所述的一對(duì)內(nèi)側(cè)引物為：Zika-BIP：5’-GTCTGGCACCCTAGTGTCCACTCACAGGAATAGCCATGACCG-3’(SEQNO.3)；Zika-FIP：5’-AGGCACTCGTCAGGTTATGAGCTACAGACTCGTGGCCGTT-3’(SEQNO.4)；所述的一對(duì)環(huán)引物為：Zika-LF：5’-TGACCATACGGTGTGGTGT-3’(SEQNO.5)；Zika-LB：5’-ATGGTCTCTTCCTGGTTGTGG-3’(SEQNO.5)；上述環(huán)引物Zika-LB5’端標(biāo)記生物素(Biotin)，環(huán)引物Zika-LF5’端標(biāo)記6-羧基熒光素(6-FAM)；(3)將核酸層析試紙垂直插入所述的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中，層析5-10min，然后按以下方法判讀結(jié)果：陽性(+)：核酸層析試紙條的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)分別出現(xiàn)一條紅色條帶；陰性(-)：核酸層析試紙條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，而檢測(cè)區(qū)則沒有條帶；無效：核酸層析試紙條的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均未出現(xiàn)條帶；其中，所述的核酸層析試紙條包括條狀的塑料支撐片，該塑料支撐片的一表面自一頭至另一頭依次設(shè)有樣品墊、聚酯纖維素膜、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述聚酯纖維素膜上噴涂有一層由氯金酸制成的膠體金顆粒上制得的鏈霉親和素包被的AuNPs金納米粒子；所述硝酸纖維素膜上分布有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，其中檢測(cè)區(qū)是在硝酸纖維素膜上噴涂生物素親和蛋白形成，質(zhì)控區(qū)是在硝酸纖維素膜上噴涂6-羧基熒光素抗體形成。上述方案中，所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法的反應(yīng)體系為：12.5μL2×反應(yīng)緩沖液(RM)，1μL酶溶液(EM)，濃度為10μM的一對(duì)外引物各0.5μL、濃度為10μM的一對(duì)內(nèi)引物各4μL，濃度為10μM的一對(duì)環(huán)引物各2μL，RNA模板1μL；所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法的反應(yīng)條件為：65℃溫育60min，85℃溫育5min。本專利技術(shù)所述的方法將環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與核酸層析試紙條聯(lián)合使用，因此具有特異性好，靈敏度高，快速高效，無污染，能準(zhǔn)確、快速檢測(cè)寨卡病毒的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于寨卡感染以及混合感染寨卡病毒的早期鑒別診斷、疫情防控、檢驗(yàn)檢疫等多個(gè)領(lǐng)域，尤其是寨卡病毒流行爆發(fā)期大樣本量的檢測(cè)。附圖說明圖1是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在濁度儀引物考察結(jié)果示意圖。圖2是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物引物考察結(jié)果可視化示意圖。圖3是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在濁度儀溫度考察結(jié)果示意圖。圖4是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物溫度考察結(jié)果可視化示意圖。圖5是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒LAMP檢測(cè)特異性試驗(yàn)示意圖。圖6是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒LAMP檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果可視化示意圖。圖7是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒LAMP檢測(cè)靈敏度示意圖。圖8是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒LAMP檢測(cè)靈敏度結(jié)果可視化示意圖。圖9是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒One-StepRT-PCR特異性和靈敏度電泳圖。圖10是本專利技術(shù)實(shí)施例提供的寨卡病毒臨床樣品血清的檢測(cè)結(jié)果可視化圖。圖11和12是本專利技術(shù)所述核酸層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖11為主視圖，圖12為俯視圖。具體實(shí)施方式為了使本專利技術(shù)的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合寨卡病毒實(shí)施例，對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。本專利技術(shù)建立寨卡病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，針對(duì)寨卡病毒NS5基因序列設(shè)計(jì)并合成特異性LAMP引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，分析其靈敏度和特異性，結(jié)果表明所建立的寨卡病毒快速檢測(cè)檢測(cè)方法，對(duì)登革病毒4種血清型流感病毒H1N1無檢出，可檢出稀釋至10-6(濃度為120fg/μl)的RNA，特異性、靈敏度及穩(wěn)定性良好。此方法簡(jiǎn)單、快速，恒溫水浴鍋65℃反應(yīng)60min即可完成。反應(yīng)時(shí)，加入的環(huán)引物為熒光標(biāo)記引物，產(chǎn)物進(jìn)行濁度法檢測(cè)和橫向流核酸層析試紙條檢測(cè)，比較兩者檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證橫向流核酸層析試紙條檢測(cè)的準(zhǔn)確、特異、靈敏性能。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。如圖1所示，本專利技術(shù)實(shí)施例的快速檢測(cè)寨卡病毒的方法包括以下步驟：(1)獲取寨卡病毒(武漢大學(xué)病毒研究所提供)、4種血清型登革病毒(廣東省疾病預(yù)防控制中心提供)，將病毒原液接種到長滿C6/36細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞病變率達(dá)到90％時(shí)，收集培養(yǎng)液上清，1500r離心15min，將上清分裝，-80℃保存，待用；H1N1流感病毒(廣東省疾病預(yù)防控制中心提供)，用A549細(xì)胞培養(yǎng)。本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種寨卡病毒的可視化檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：(1)取寨卡病毒，按北京全式金生物科技有限公司生產(chǎn)的Easy?Pure?Viral?DNA/RNA?Kit的說明書提取寨卡病毒核酸；(2)以步驟(1)得到的寨卡病毒核酸為模板，采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法擴(kuò)增寨卡病毒NS5基因的RNA片段，獲得核酸擴(kuò)增產(chǎn)物；所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法的引物由一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物組成，其中，所述的一對(duì)外引物為：Zika?F3：5’?TGGGATGTGGTGACTGGA?3’(SEQ?NO.1)；Zika?B3：5’?TGCATTGCTACGAACCTTGT?3’(SEQ?NO.2)；所述的一對(duì)內(nèi)側(cè)引物為：Zika?BIP：5’?GTCTGGCACCCTAGTGTCCACTCACAGGAATAGCCATGACCG?3’(SEQ?NO.3)；Zika?FIP：5’?AGGCACTCGTCAGGTTATGAGCTACAGACTCGTGGCCGTT?3’(SEQ?NO.4)；所述的一對(duì)環(huán)引物為：Zika?LF：5’?TGACCATACGGTGTGGTGT?3’(SEQ?NO.5)；Zika?LB：5’?ATGGTCTCTTCCTGGTTGTGG?3’(SEQ?NO.5)；上述環(huán)引物Zika?LB5’端標(biāo)記生物素(Biotin)，環(huán)引物Zika?LF5’端標(biāo)記6?羧基熒光素(6?FAM)；(3)將核酸層析試紙垂直插入所述的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中，層析5?10min，然后按以下方法判讀結(jié)果：陽性(+)：核酸層析試紙條的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)分別出現(xiàn)一條紅色條帶；陰性(?)：核酸層析試紙條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，而檢測(cè)區(qū)則沒有條帶；無效：核酸層析試紙條的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均未出現(xiàn)條帶；其中，所述的核酸層析試紙條包括條狀的塑料支撐片，該塑料支撐片的一表面自一頭至另一頭依次設(shè)有樣品墊、聚酯纖維素膜、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述聚酯纖維素膜上噴涂有一層由氯金酸制成的膠體金顆粒上制得的鏈霉親和素包被的AuNPs金納米粒子；所述硝酸纖維素膜上分布有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控帶區(qū)，其中檢測(cè)區(qū)是在硝酸纖維素膜上噴涂生物素親和蛋白形成，質(zhì)控區(qū)是在硝酸纖維素膜上噴涂6?羧基熒光素抗體形成。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種寨卡病毒的可視化檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：(1)取寨卡病毒，按北京全式金生物科技有限公司生產(chǎn)的EasyPureViralDNA/RNAKit的說明書提取寨卡病毒核酸；(2)以步驟(1)得到的寨卡病毒核酸為模板，采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法擴(kuò)增寨卡病毒NS5基因的RNA片段，獲得核酸擴(kuò)增產(chǎn)物；所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法的引物由一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物組成，其中，所述的一對(duì)外引物為：Zika-F3：5’-TGGGATGTGGTGACTGGA-3’(SEQNO.1)；Zika-B3：5’-TGCATTGCTACGAACCTTGT-3’(SEQNO.2)；所述的一對(duì)內(nèi)側(cè)引物為：Zika-BIP：5’-GTCTGGCACCCTAGTGTCCACTCACAGGAATAGCCATGACCG-3’(SEQNO.3)；Zika-FIP：5’-AGGCACTCGTCAGGTTATGAGCTACAGACTCGTGGCCGTT-3’(SEQNO.4)；所述的一對(duì)環(huán)引物為：Zika-LF：5’-TGACCATACGGTGTGGTGT-3’(SEQNO.5)；Zika-LB：5’-ATGGTCTCTTCCTGGTTGTGG-3’(SEQNO.5)；上述環(huán)引物Zika-LB5’端標(biāo)記生物素(B...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李耿，張威，陳思泰，吳建國，賴小平，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東,44