HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉及其制備和應用制造技術

本發明專利技術公開了一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，按質量百分比包括以下組分：人臍帶MSC無血清培養液活性蛋白成分5～12％，殼聚糖20～65％，三聚磷酸鈉1～15％，透明質酸20～65％，水≤5％。其制備方法為，先采用CS納米粒制備工藝將具有多種活性細胞因子的干細胞無血清培養上清液包覆，進而凍干，再使CS納米粒表面的活性氨基與HA表面的羧基發生共價偶聯反應，制得本發明專利技術產品。該產品凍干粉水化后，直接加入化妝品中，可起到抗皺保濕及延緩細胞老化作用，該產品具有較長保質期。

HA modified human umbilical cord MSC serum free culture medium CS nanoparticle freeze-dried powder and preparation and application thereof

The invention discloses a HA modified human umbilical cord MSC liquid CS nanoparticles lyophilized powder serum medium comprises the following components by weight percentage: human umbilical cord MSC serum-free medium active protein components of 5 ~ 12%, 20 ~ 65% chitosan, sodium tripolyphosphate 1 ~ 15%, 20 ~ 65% of hyaluronic acid, water less than or equal to 5%. The preparation method is that first preparation process will have various active cytokines in serum free culture supernatant of stem cells coated with CS nanoparticles, and then freeze-dried, then make CS nanoparticles surface active amino and carboxyl groups of HA covalent coupling reaction, the prepared products. The product is directly added into the cosmetics after hydration of the freeze-dried powder, and can play the role of anti wrinkle, moisturizing and delaying cell aging, and the product has a long shelf life.

【技術實現步驟摘要】
HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉及其制備和應用
本專利技術屬于干細胞培養液化妝品領域，涉及一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，還涉及了該凍干粉的制備方法，及其在化妝品中的應用。
技術介紹
干細胞美容最早是在整形外科中的應用，而整形外科中應用的較多的干細胞種類是間充質干細胞、表皮干細胞、血管內皮祖細胞及前脂肪細胞等。傳統上所謂的干細胞美容術，一般都是直接注射干細胞針劑。而這種注射用干細胞的來源主要是從流產的胚胎中提取的，所以難免會引起免疫排斥反應，而且存在一定的倫理問題。即使是采用自體干細胞，但是在干細胞的培養擴增過程中會引入外源性的蛋白(胎牛血清)，容易引起免疫排斥反應。人間充質干細胞(mesenchymalstemcell，MSC)在培養中分泌堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、人表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和肝細胞生長因子(HGF)在內的多種促進皮膚細胞再生的生長因子。這些具有生物活性的生長因子能夠有效的促進皮膚細胞的新陳代謝；促進細胞外透明質酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增強皮膚的親水性；促進表皮細胞的生長、分化和修復，使衰老死亡的細胞得以及時補充；同時能夠加速角質層修復，加速基底新老細胞更替，使肌膚回到年輕姿態。液態的人間充質干細胞培養上清在常溫保存時間很短，細胞生長因子易失活，即使是通過冷凍干燥技術除去水分做成凍干粉，也很難直接添加到各種劑型的化妝品中，因此在很大程度上限制了其在化妝品領域的應用。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的是提供一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，解決液態干細胞培養上清保存期有限這一瓶頸，同時解決干細胞培養上清中細胞生長因子活性保存問題。本專利技術的第二個目的是提供上述人臍帶MSC無血清細胞培養液CS納米粒凍干粉的制備方法。本專利技術的第三個目的提供上述人臍帶MSC無血清細胞培養液CS納米粒凍干粉的應用，解決現有美容用人臍帶MSC培養液難以直接加入化妝品的問題。本專利技術所采用的第一個技術方案是，一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，按質量百分比包括以下組分：人臍帶MSC無血清培養液活性蛋白成分5～12％，CS(殼聚糖)20～65％，TPP(三聚磷酸鈉)1～15％，HA(透明質酸)20～65％，水≤5％，以上各組分的質量總和是100％。本專利技術所采用的第二個技術方案是，上述HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉的制備方法，包括以下步驟：步驟1，制備負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒；將人臍帶MSC無血清培養液加入CS酸溶液中，并加入TPP，室溫反應。將反應后的納米粒混懸液離心，所得沉淀洗滌、冷凍干燥，得到負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒。步驟2，制備HA修飾的負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉；對HA中的羧基進行活化，然后將負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒加入到活化后的HA中反應，取反應后的納米混懸液，離心，所得沉淀洗滌并冷凍干燥，即得HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉。其中，步驟1中人臍帶MSC無血清培養液的制備方法為：取新生兒臍帶，將靜脈內血跡洗滌干凈；去除表皮、兩條動脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎，加入含FBS的DMEM/F12培養基培養，得到原代人臍帶間充質干細胞；當細胞融合度為80％-90％時，胰蛋白酶消化細胞傳代培養，取傳代細胞，繼續培養，當細胞融合度80％-90％時，棄含FBS的培養上清，PBS洗滌細胞，加入無血清的DMEM/F12培養基繼續培養72小時，收集無血清培養液。殼聚糖(CS)又叫脫乙酰甲殼素，可溶性甲殼素和聚氨基葡萄糖等，其化學名為β-(1-4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，系甲殼素用濃堿處理后脫去乙酰基而得到的產物。殼聚糖是天然高分子中少有的堿性多糖，不溶于水和有機溶劑，可溶于pH＜6.5的稀酸，在稀酸中，其葡萄糖氨基轉化為R-NH3+,形成聚陽離子凝膠溶液。殼聚糖具有優良的生物可降解性、低毒、良好的生物相容性，因此非常適合用于生物醫藥及化妝品行業。本專利技術采用離子交聯法制備CS納米粒，利用無不良反應的三聚磷酸鈉(TPP)對CS進行離子誘導凝膠化形成納米粒。在攪拌下，將TPP溶液加入到CS的酸溶液中，通過帶負電的磷酸根離子與CS分子鏈上帶正電的質子化氨基發生分子內和分子間交聯凝膠化，便可迅速生成納米粒。透明質酸(HA)是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高分子多糖，是最佳的保濕成分之一。在一定的pH值條件下，透明質酸帶負電荷，而CS納米粒帶正電荷，兩者之間能夠通過靜電力相互吸引，使CS納米粒具有良好的保濕作用。本專利技術的特點還在于：優選地，步驟1中CS和人臍帶MSC無血清培養液中活性蛋白的質量比為2:1～10:1，CS與TPP的質量比為2:1～5:1，CS的分子量為2-30萬。優選地，步驟1所述CS酸溶液中用于溶解CS的酸是甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、抗壞血酸、草酸、丁二酸、丙二酸、脂肪酸、丙酮酸、戊二酸、酒石酸、天冬氨酸、水楊酸或乙醇酸中的一種或幾種。優選地，步驟1中離心參數為：離心溫度2～8℃，離心時間10～60min，離心力1.0×103～1.0×105g。優選地，步驟2中HA的分子量為8-30Kda，HA和負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒的質量比為1:1～5:1。優選地，步驟2中HA的羧基活化方法為，采用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)對HA中的羧基進行活化，然后調節pH至7.5，37℃孵育。優選地，步驟1和步驟2中冷凍干燥參數均為：預凍溫度-60℃±2℃，預凍時間6h以上，冷凍溫度-50～-56℃，真空度≤80mT，凍干時間24-36h。本專利技術所采用的第三個技術方案是，上述人臍帶MSC無血清細胞培養液CS納米粒凍干粉在化妝品中的應用。制備化妝品時，將上述HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉水化后，直接加入化妝品中。該凍干粉可直接添加于常見的乳液、霜膏、精華液、凝膠等多種劑型的化妝品。本專利技術的有益效果是：(1)本專利技術所用的干細胞培養上清液為無血清培養上清，減小了干細胞用于美容中存在的免疫排斥反應。(2)采用CS納米粒制備工藝將具有多種活性細胞因子的干細胞無血清培養上清液包覆，進而凍干，保質期可長達三年，遠高于現有人間充質干細胞的保質期，解決了上清液保存期短的問題。(3)CS納米粒表面的活性氨基與HA表面的羧基發生共價偶聯反應，制得HA修飾CS納米粒，這樣不僅解決了CS納米粒穩定性差的問題，同時在CS納米粒中引入了化妝品高效保濕劑HA。(4)本專利技術所用的CS作為一種天然堿性多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，安全性較高、成本低廉，采用CS制備納米粒，反應條件溫和，工藝簡單、成本低。(5)經CS納米粒包覆后的干細胞無血清培養上清液可直接添加于乳液、霜膏、精華液、凝膠等多種劑型的化妝品，拓寬了其在化妝品領域的應用。附圖說明圖1為本專利技術HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉的制備方法流程圖；圖2MSC-CS-NPs和HA-MSC-CS-NPs48h流式細本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，其特征在于，按質量百分比包括以下組分：人臍帶MSC無血清培養液活性蛋白成分5～12％，殼聚糖20～65％，三聚磷酸鈉1～15％，透明質酸20～65％，水≤5％，以上各組分的質量總和是100％。

【技術特征摘要】
1.一種HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，其特征在于，按質量百分比包括以下組分：人臍帶MSC無血清培養液活性蛋白成分5～12％，殼聚糖20～65％，三聚磷酸鈉1～15％，透明質酸20～65％，水≤5％，以上各組分的質量總和是100％。2.一種如權利要求1所述的HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1，制備負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒；將人臍帶MSC無血清培養液加入CS酸溶液中，并加入TPP，室溫反應；將反應后的納米粒混懸液離心，所得沉淀洗滌、冷凍干燥，得到負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒；步驟2，制備HA修飾的負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉；對HA中的羧基進行活化，然后將負載人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒加入到活化后的HA中反應，取反應后的納米混懸液，離心，所得沉淀洗滌并冷凍干燥，即得HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉。3.根據權利要求2所述的HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉的制備方法，其特征在于，步驟1中所述人臍帶MSC無血清培養液的制備方法為：取新生兒臍帶，將靜脈內血跡洗滌干凈；去除表皮、兩條動脈血管及一條靜脈血管，將組織剪碎，加入含FBS的DMEM/F12培養基培養，得到原代人臍帶間充質干細胞；當細胞融合度為80％-90％時，胰蛋白酶消化細胞傳代培養，取傳代細胞，繼續培養，當細胞融合度80％-90％時，棄含FBS的培養上清，PBS洗滌細胞，加入無血清的DMEM/F12培養基繼續培養72小時，收集無血清培養液。4.根據權利要求2所述的HA修飾的人臍帶MSC無血清培養液CS納米粒凍干粉，其特征在于，步驟1中所述CS和人臍帶MSC...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王靜，盧榮，趙文靜，胡春梅，馬雅婷，
申請(專利權)人：西安艾爾菲生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：陜西,61