一種經由細胞片層獲得磷酸鈣/細胞外基質薄膜的方法技術

本發明專利技術公開了一種經由細胞片層獲得磷酸鈣/細胞外基質薄膜的方法，細胞外基質的來源為成纖維細胞、成骨細胞等。制備該薄膜主要通過在TiO

A method for obtaining calcium phosphate / extracellular matrix films via a cell slice

The present invention discloses a method for obtaining calcium phosphate / extracellular matrix film through cell slice layer, and the sources of extracellular matrix are fibroblast, osteoblast and so on. The films were prepared mainly by TiO

【技術實現步驟摘要】
一種經由細胞片層獲得磷酸鈣/細胞外基質薄膜的方法
本專利技術涉及組織工程領域，具體涉及一種經由細胞片層獲得細胞外基質薄膜的方法。
技術介紹
細胞外基質為宿主細胞提供一切生命活動所必須的物質和信號的支持，它是細胞生長過程分泌的膠原、糖蛋白、蛋白聚糖以及多種生長因子等組成的復雜網絡結構，對細胞的形狀、生長、遷移和分化，胚胎的發育以及受損組織或器官的修復等有至關重要的作用。有學者通過機械剝離法獲得一層較厚纖維母細胞片層，并通過去細胞化制備得到纖維狀的細胞外基質膜，研究發現，所獲得的細胞外基質薄膜能夠促進人骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化[QiX,QianZ,KannanB,etal.OsteogenicDifferentiationEvaluationofanEngineeredExtracellularMatrixBasedTissueSheetforPotentialPeriosteumReplacement[J].AcsAppliedMaterials&Interfaces,2015,7(41)]。因此，如能在體外獲得細胞外基質薄膜具有很強的實際應用意義和研究價值。在體外培養過程中，細胞本身可分泌出細胞外基質并形成包含了細胞外基質及細胞的細胞薄層，但這之后通常的處理方式是酶處理，消化掉細胞外基質使細胞脫離培養表面，無法獲得所需的細胞外基質。而如單采用機械剝離方式，其過程中對細胞片層及細胞外基質造成了一定的機械損傷，從而使細胞外基質超微結構發生一定變化，最終影響后續對其它細胞的增殖分化的促進作用。本專利技術在近年來的報道的光致細胞薄層獲取技術基礎上，開發了一種經由細胞薄層獲取細胞外基質薄膜的方法。該方法利用光致細胞薄層脫附技術能夠獲得具有細胞外基質含量高、活性功能良好的細胞薄層的特點[Y.Hong,M.F.Yu,W.J.Weng,K.Cheng,H.M.Wang,J.Lin.Light-inducedcelldetachmentforcellsheettechnology.Biomaterials,2013,34(1):11-18]，將之通過一系列的處理形成了一種具有高活性的細胞外基質薄膜。該方法獲得的細胞外基質薄膜保持了原有的超微結構和組成成分，并具有良好的韌性，可應用于組織工程等領域。這意味薄層中的細胞具有良好的活性。同時，磷酸鈣材料也是一種廣泛應用于組織修復的材料。有鑒于此，本專利技術開發一種將細胞薄層磷酸鈣復合后得到磷酸鈣/細胞外基質復合薄膜的方法。本專利技術的制備方法，工藝簡單，易于實現，有利于進行推廣應用，所得到的復合薄膜具有良好的生物相容性和組織修復特性。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種經由細胞片層獲得磷酸鈣/細胞外基質薄膜的方法。制備上述的細胞外基質薄膜的方法，包括如下步驟：(1)對可光致細胞脫附的細胞培養表面進行滅菌處理；(2)將事先培養在培養瓶中的細胞進行脫壁處理，以800～1300r/min離心2～6min后，用DMEM培養基混懸，并用計數器計數，以1×105～1×106細胞密度將細胞接種于細胞培養表面上，置于二氧化碳培養箱內進行單層高密度培養，2～4天后進行第一次換液，之后每2～3天換液一次，整個培養周期5～10天，最終在細胞培養表面上形成完整的細胞片層；(3)通過波長長于350nm的紫外光或可見光光照5～30min，使細胞片層從細胞培養表面上完整脫附，獲得一層完整的細胞片層，用PBS緩沖液以及去離子水反復清洗，用固定劑對細胞片層進行固定，避光處理30～60min；(4)將細胞片層浸泡在0.01～0.06mol/L的氫氧化鈣溶液中1～10分鐘，取出后在-55℃冷凍30分鐘，取出后在20～37℃解凍，上述冷凍-解凍循環重復3～10次，之后用PBS緩沖液沖洗，最后用去離子水清洗，最終獲得一層磷酸鈣/細胞外基質薄膜。所述的細胞培養表面為表面涂有TiO2納米點薄膜的石英玻璃、硅酸鹽玻璃、鉭金屬片、鈦金屬片或鈦鎳合金片，或具有P/N結的硅片。細胞外基質的來源為成纖維細胞、成骨細胞等。所述的固定劑為甲醛、多聚甲醛、戊二醇、乙醇、丙醇或丁醇。本專利技術的制備方法具有如下特點：1)采用表面含有TiO2納米點薄膜的基板進行細胞培養，通過紫外光燈照射，使細胞從基板上脫附下來，減少細胞片層的機械損傷，從而獲得完整的細胞片層。2)干燥處理前采用固定劑進行處理，保持了細胞外基質的原有微觀結構。本專利技術所涉及的細胞外基質薄膜的制備過程，無論是細胞的體外培養，細胞片層的脫附，還是磷酸鈣的復合，都是比較簡潔易行的，對設備沒有過高的要求。本專利技術的細胞外基質薄膜，保持了原有的結構形貌，具有良好的生物相容性，為培養同種或異種細胞提供了有利的微環境，有利于細胞的粘附、增值，對細胞的分化也產生影響，可應用于組織工程等領域。此外本專利技術的制備方法，工藝簡單，易于實現，有利于進行推廣應用。附圖說明圖1是實例1制得的磷酸鈣/細胞外基質薄膜的表面形貌圖。具體實施方式下面結合附圖和具體實施例對本專利技術作進一步說明。實施例1(1)對表面涂有TiO2的石英玻璃進行滅菌處理；(2)將事先培養在培養瓶中的細胞進行脫壁處理，以800r/min離心6min后，用DMEM培養基混懸，并用計數器計數，以1×105細胞密度將細胞接種于細胞培養表面上，置于二氧化碳培養箱內進行單層高密度培養，4天后進行第一次換液，之后每3天換液一次，整個培養周期10天，最終在細胞培養表面上形成完整的細胞片層；(3)通過波長長于350nm的紫外光光照5min，使細胞片層從細胞培養表面上完整脫附，獲得一層完整的細胞片層，用PBS緩沖液以及去離子水反復清洗2遍，用甲醛對細胞片層進行固定，避光處理30min；(4)將細胞片層浸泡在0.01mol/L的氫氧化鈣溶液中1分鐘，取出后在-55℃冷凍30分鐘，取出后在20℃解凍。冷凍-解凍循環重復3次。之后用PBS緩沖液沖洗3遍，最后用去離子水清洗3遍，最終獲得一層磷酸鈣/細胞外基質薄膜。本例制得的磷酸鈣/細胞外基質薄膜的表面形貌圖如圖1所示，可以看出薄膜存在一定的孔狀結構。實施例2(1)對表面涂有TiO2的硅酸鹽玻璃進行滅菌處理；(2)將事先培養在培養瓶中的細胞進行脫壁處理，以900r/min離心3min后，用DMEM培養基混懸，并用計數器計數，以3×105細胞密度將細胞接種于基板上，置于二氧化碳培養箱內進行單層高密度培養，4天后進行第一次換液，之后每3天換液一次，整個培養周期9天，最終在基板上形成完整的細胞片層；(3)通過波長長于350nm的紫外光光照15min，使細胞片層從細胞培養表面上完整脫附，獲得一層完整的細胞片層，用PBS緩沖液以及去離子水反復清洗2遍，用多聚甲醛對細胞片層進行固定，避光處理35min；(4)將細胞片層浸泡在0.02mol/L的氫氧化鈣溶液中3分鐘，取出后在-55℃冷凍30分鐘，取出后在23℃解凍。冷凍-解凍循環重復4次。之后用PBS緩沖液沖洗3遍，最后用去離子水清洗3遍，最終獲得一層磷酸鈣/細胞外基質薄膜。本例制得的細胞外基質薄膜存在一定的孔狀結構，生物相容性較好。實施例3(1)對表面涂有TiO2的鉭金屬片進行滅菌處理；(2)將事先培養在培養瓶中的細胞進行脫壁處理，以1000r/min離心4min后，用DM本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種經由細胞片層獲得磷酸鈣/細胞外基質薄膜的方法，其特征在于包括如下步驟：(1)對可光致細胞脫附的細胞培養表面進行滅菌處理；(2)將事先培養在培養瓶中的細胞進行脫壁處理，以800～1300r/min離心2～6min后，用DMEM培養基混懸，并用計數器計數，以1×10

【技術特征摘要】
1.一種經由細胞片層獲得磷酸鈣/細胞外基質薄膜的方法，其特征在于包括如下步驟：(1)對可光致細胞脫附的細胞培養表面進行滅菌處理；(2)將事先培養在培養瓶中的細胞進行脫壁處理，以800～1300r/min離心2～6min后，用DMEM培養基混懸，并用計數器計數，以1×105～1×106細胞密度將細胞接種于上述細胞培養表面上，置于二氧化碳培養箱內進行單層高密度培養，2～4天后進行第一次換液，之后每2～3天換液一次，整個培養周期5～10天，最終在細胞培養表面上形成完整的細胞片層；(3)通過波長長于350nm的紫外光或可見光光照5～30min，使細胞片層從細胞培養表面上完整脫附，獲得一層完整的細胞片層，用PBS緩沖液以及去離子水反復清洗，用固定劑對細胞片層...

【專利技術屬性】
技術研發人員：程逵，周貝貝，陳樽，翁文劍，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：浙江,33