從植物脂質生產工業產品的方法技術

本發明專利技術涉及從植物脂質，特別是從植物的營養性部分生產工業產品的方法。特別地，本發明專利技術提供油產品如生物柴油和合成柴油以及生產這些的方法，以及具有升高水平的一種或多種非極性脂質如三酰甘油和增加的總非極性脂質含量的植物。在一特定實施方案中，本發明專利技術涉及脂質操作酶、油體蛋白、減少脂質分解代謝酶和/或調節脂質生物合成的轉錄因子中的兩種或更多種的修飾的組合，以便提高植物或其任何部分中的一種或多種非極性脂質和/或總非極性脂質含量和/或單不飽和脂肪酸含量的水平。在一實施方案中，本發明專利技術涉及一種提取脂質的方法。在另一實施方案中，在收獲的植物營養性部分中將脂質轉化為一種或多種烴類產物以產生脂肪酸的烷基酯，其適合用作可再生的生物柴油燃料。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】從植物脂質生產工業產品的方法專利
本專利技術涉及從植物脂質，特別是從植物的營養性部分生產工業產品的方法。特別地，本專利技術提供油產品如生物柴油和合成柴油以及生產這些的方法，以及具有升高水平的一種或多種非極性脂質如三酰甘油和增加的總非極性脂質含量的植物。在一特定實施方案中，本專利技術涉及脂質操作酶、油體蛋白(oilbodyprotein)、減少脂質分解代謝酶和/或調節脂質生物合成的轉錄因子中的兩種或更多種的修飾的組合，以便提高植物或其任何部分中的一種或多種非極性脂質和/或總非極性脂質含量和/或單不飽和脂肪酸含量的水平。在一實施方案中，本專利技術涉及一種提取脂質的方法。在另一實施方案中，在收獲的植物營養性部分中將脂質轉化為一種或多種烴類產品以產生脂肪酸的烷基酯，其適合用作可再生的生物柴油燃料。專利技術背景世界能源的大部分，特別是用于運輸的能源，是由石油衍生燃料所提供，其供應有限。需要可再生的替代來源，如來自生物學產生的油。三酰甘油生物合成三酰甘油(TAG)構成了種子中脂質的主要形式并且由酯化至甘油骨架的三個酰基鏈所組成。脂肪酸在質體中作為酰基-酰基載體蛋白(ACP)中間體合成，在此其可經歷第一次催化的去飽和。此反應由硬脂酰基-ACP去飽和酶催化并產生油酸(C18：1Δ9)。隨后，酰基鏈作為酰基輔酶(CoA)硫酯被轉移至細胞質和內質網(ER)。在進入主要TAG生物合成途徑之前，也已知為Kennedy或甘油-3-磷酸(G3P)途徑，酰基鏈通常被整合至ER膜的磷脂中，在此其可經歷進一步去飽和。多不飽和脂肪酸生產中的兩種關鍵酶是膜結合的FAD2和FAD3去飽和酶，其分別產生亞油酸(C18：2Δ9，12)和α-亞麻酸(C18：3Δ9，12，15)。經Kennedy途徑的TAG生物合成由一系列相繼的酰基化所組成，每個均使用酰基-CoA酯作為酰基-供體。第一個酰基化步驟通常在G3P骨架的sn1-位置處發生并由甘油-3-磷酸酰基轉移酶(sn1-GPAT)催化。產物sn1-溶血磷脂酸(sn1-LPA)作為溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAAT)的底物，其將第二個酰基鏈連接至sn2-位置以形成磷脂酸。PA進一步被磷脂酸磷酸酶(PAP)去磷酸化成二酰甘油(DAG)，由此提供用于最后的酰基化步驟的底物。最后，第三個酰基鏈在由二酰甘油酰基轉移酶(DGAT)催化的反應中被酯化至DAG的sn3-位置，以形成在油體中聚集的TAG。第二個酶反應，磷脂酰甘油酰基轉移酶(PDAT)，也導致DAG被轉化成TAG。此反應與DGAT無關并且使用磷脂作為酰基-供體。為了最大程度提高脂質商業生產的產率，需要提高轉基因生物或其部分諸如植物、種子、葉、藻類和真菌中脂質(尤其是非極性脂質諸如DAG和TAG)水平的更多措施。提高植物中的中性脂質產量的嘗試主要集中在脂肪酸生物合成或TAG組裝中所涉及的單個關鍵酶促步驟。然而這些策略已導致種子或葉中油含量一般程度的提高。最近在產油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)中的代謝工程工作已證實提高甘油-3-磷酸生產和防止TAG經β-氧化破壞的組合手段導致總脂質含量的累積增加(Dulermoeta1.，2011)。植物脂質諸如種子油三酰甘油(TAG)具有許多用途，例如烹飪用途(起酥油、質地、調味)、工業用途(用于肥皂、蠟燭、香水、化妝品、適合作為干燥劑、絕緣體、潤滑劑)，以及提供營養價值。使用植物脂質生產生物燃料的興趣也在不斷增長。為了最大程度提高脂質商業生物生產的產率，需要提高轉基因生物或其部分諸如植物、種子、葉、藻類和真菌中脂質(尤其是非極性脂質諸如DAG和TAG)水平的更多措施。專利技術概述本專利技術人已發現一種從營養性植物部分生產油產品的方法。在第一方面，本專利技術提供一種生產油產品的方法，所述方法包括以下步驟：(i)在反應器中處理組合物，所述組合物包含(a)營養性植物部分，其干重為至少2g，并且在干重基礎上其具有至少5重量％的總非極性脂質含量，(b)溶劑，其包含水、醇或兩者，以及(c)任選存在的催化劑，其中所述處理包括在氧化、還原或惰性環境中于約50℃-約450℃的溫度和5-350巴的壓力下加熱所述組合物1-120分鐘，(ii)以相對于所述營養性植物部分的干重至少35重量％的收率從所述反應器回收油產品，從而生產所述油產品。在一實施方案中，所述營養性植物部分具有至少1kg的干重。在一實施方案中，在干重基礎上，所述營養性植物部分具有至少10％、至少15％、至少20％、約25％、約30％、約35％、10％-75％、20％-75％或優選30％-75％的總非極性脂質含量。在一實施方案中，所述組合物具有5％-90％，優選15％-50％(干重/重量)的固體濃度。可以使用任何合適的催化劑。在一實施方案中，所述催化劑為堿、酸或貴金屬催化劑。例如，在一實施方案中，所述催化劑包含NaOH或KOH或兩者，優選濃度為0.1M-2M。在一實施方案中，所述處理時間為1-60分鐘，優選10-60分鐘，更優選15-30分鐘。在一實施方案中，當壓力少于50巴時，反應時間可以長達24小時或甚至長達7天。在一優選實施方案中，溫度為275℃-360℃，壓力為100-200巴，并且反應發生在10-60min中。在一實施方案中，如果所述溶劑為水，則所述方法產生最小36重量％、37重量％、38重量％、39重量％或40重量％以及最大55重量％或優選60重量％(相對于所述營養性植物部分的干重)之間的油產品收率。在這個實施方案中，所述油產品包含比脂肪酰基酯多至少2-倍，優選至少3-倍的碳氫化合物。優選地，所述油產品包含35％，更優選40％C13-C22碳氫化合物。在另一實施方案中，如果所述溶劑包含醇，優選甲醇，則所述方法產生最小36重量％、37重量％、38重量％、39重量％或40重量％以及最大65重量％或優選70重量％(相對于所述營養性植物部分的干重)之間的油產品收率。在這個實施方案中，所述油產品包含比碳氫化合物多至少1.5-倍，優選至少2-倍的脂肪酰基酯。優選地，所述油產品包含40％，更優選50％脂肪酸甲基酯。在另一實施方案中，如果所述溶劑包含約80％水，則所述油產品包含約30％的C13-C22碳氫化合物，優選約35％，更優選約40％C13-C22碳氫化合物。在另一實施方案中，如果所述溶劑包含約50％甲醇，則所述油產品包含約50％脂肪酸甲基酯(FAME)。在另一實施方案中，回收的油產品具有少于約15重量％，優選少于5重量％的水含量。在另一實施方案中，相對于利用相應營養性植物部分(在干重基礎上其非極性脂質含量少于2％)的相應方法，油產品的收率大至少2重量％，優選大至少4重量％。在一實施方案中，已通過干燥、劈砍(chopping)、切碎(shredding)、磨制(milling)、輾壓(rolling)、壓榨(pressing)、破碎(crashing)或研磨(grinding)中的一種或多種物理加工步驟(i)(a)中的營養性植物部分。在一可選實施方案中，所述營養性植物部分在制備所述組合物之前尚未干燥至少于10％的水分含量。例如，所述營養性植物部分具有至少20％或至少30％的水分含量，或者所述營養性植物部分保留在它們收獲時具有的至少50％的水含量。在一實施方案中，所本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種生產油產品的方法，所述方法包括以下步驟：(i)在反應器中處理組合物，所述組合物包含(a)營養性植物部分，其干重為至少2g，并且在干重基礎上其具有至少5重量％的總非極性脂質含量，(b)溶劑，其包含水、醇或兩者，以及(c)任選存在的催化劑，其中所述處理包括在氧化、還原或惰性環境中于約50℃?約450℃的溫度和5?350巴的壓力下加熱所述組合物1?120分鐘，(ii)以相對于所述營養性植物部分的干重至少35重量％的收率從所述反應器回收油產品，從而生產所述油產品。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.07.07 AU 2014902617;2015.01.13 AU 2015900084;1.一種生產油產品的方法，所述方法包括以下步驟：(i)在反應器中處理組合物，所述組合物包含(a)營養性植物部分，其干重為至少2g，并且在干重基礎上其具有至少5重量％的總非極性脂質含量，(b)溶劑，其包含水、醇或兩者，以及(c)任選存在的催化劑，其中所述處理包括在氧化、還原或惰性環境中于約50℃-約450℃的溫度和5-350巴的壓力下加熱所述組合物1-120分鐘，(ii)以相對于所述營養性植物部分的干重至少35重量％的收率從所述反應器回收油產品，從而生產所述油產品。2.權利要求1的方法，其特征在于以下一項或多項或全部：(i)所述營養性植物部分具有至少1kg的干重，(ii)在干重基礎上，所述營養性植物部分具有至少10％、至少15％、至少20％、約25％、約30％、約35％或30％-75％的總非極性脂質含量，(iii)所述組合物具有5％-90％的固體濃度(iv)所述催化劑包含NaOH或KOH或兩者，優選濃度為0.1M-2M，(v)所述處理時間為1-60分鐘，優選10-60分鐘，優選15-30分鐘，(vi)如果所述溶劑為水，則所述方法產生相對于所述營養性植物部分的干重在最小36重量％、37重量％、38重量％、39重量％或40重量％以及最大55重量％或60重量％之間的油產品收率，(vii)如果所述溶劑包含醇，則所述方法產生相對于所述營養性植物部分的干重在最小36重量％、37重量％、38重量％、39重量％或40重量％以及最大65重量％或70重量％之間的油產品收率，(viii)如果所述溶劑包含約80％水，則所述油產品包含約30％的C13-C22碳氫化合物，(ix)如果所述溶劑包含約50％甲醇，則所述油產品包含約50％脂肪酸甲基酯(FAME)，(x)回收的油產品具有少于約15重量％的水含量，(xi)相對于利用相應營養性植物部分(在干重基礎上其非極性脂質含量少于2％)的相應方法，油產品的收率大至少2重量％，(xii)已通過干燥、劈砍、切碎、磨制、碾壓、壓榨、破碎或研磨中的一種或多種物理加工步驟(i)(a)中的營養性植物部分。3.權利要求1或權利要求2的方法，其進一步包含以下一項或多項：(i)回收的油產品的加氫脫氧，(ii)用氫處理回收的油產品以降低所述油產品中的酮或糖水平，(iii)從回收的油產品生產合成氣，以及(iv)分級分離回收的油產品以生產燃料油、柴油、煤油或汽油中的一種或多種。4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述營養性植物部分包含植物葉、莖或兩者。5.一種重組真核細胞，其包含：a)第一外源多核苷酸，其編碼增加所述細胞中的一種或多種糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表達的轉錄因子多肽，b)第二外源多核苷酸，其編碼參與一種或多種非極性脂質的生物合成的多肽，以及以下任何一種或兩種或全部三種c)第一遺傳修飾，當與缺少所述遺傳修飾的相應細胞相比時，其下調參與所述細胞中的三酰甘油(TAG)分解代謝的多肽的內源生成和/或活性，d)第三外源多核苷酸，其編碼這樣的多肽，當與缺少第四外源多核苷酸的相應細胞相比時，所述多肽增加脂肪酸輸出所述細胞質體，以及e)第四外源多核苷酸，其編碼增加所述細胞中的一種或多種糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表達的第二轉錄因子多肽，其中每個外源多核苷酸可操作地連接至能夠指導所述多核苷酸在所述細胞中的表達的啟動子。6.權利要求5的細胞，其進一步包含以下一個或多個或全部：a)第五外源多核苷酸，其編碼油體包衣(OBC)多肽，b)第二遺傳修飾，當與缺少所述第二遺傳修飾的相應細胞相比時，其下調參與將脂肪酸輸入所述細胞質體的多肽的內源生成和/或活性，以及c)第三遺傳修飾，當與缺少所述第三遺傳修飾的相應細胞相比時，其下調參與質體中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的內源生成和/或活性。7.權利要求5或權利要求6的細胞，其中所述細胞是來自植物的營養性部分或植物的營養性部分中的植物細胞，并且一種或多種或全部啟動子在所述營養性部分中以相對于植物的種子更高的水平表達。8.權利要求5-7中任一項的細胞，其中以下特性中的一種或多種或全部適用：i)所述細胞相對于缺少第一外源多核苷酸的相應細胞具有增加的總脂肪酸合成，或者相對于缺少第一外源多核苷酸的相應細胞具有減少的總脂肪酸分解代謝，或者兩者，從而相對于缺少第一外源多核苷酸的相應細胞其具有升高水平的總脂肪酸，ii)相對于具有第一外源多核苷酸且缺少編碼參與一種或多種非極性脂質的生物合成的多肽的外源多核苷酸的相應細胞，所述細胞具有增加的脂肪酰基酰基轉移酶表達和/或活性，所述脂肪酰基酰基轉移酶催化TAG、DAG或MAG的合成，優選TAG，iii)相對于具有第一外源多核苷酸且缺少下調參與細胞質體中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的內源生成和/或活性的遺傳修飾的相應細胞，所述細胞在其質體中具有減少的從酰基-ACP和G3P生成溶血磷脂酸(LPA)，iv)相對于缺少外源多核苷酸和/或遺傳修飾的相應細胞，所述細胞在其總脂肪酸含量和/或其半乳糖脂含量中具有改變的C16:3-C18:3脂肪酸比例，優選減少的比例，v)所述細胞在植物的營養性部分中，并且包含至少約8％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、8％-75％、10％-75％、11％-75％、約15％-75％、約20％-75％、約30％-75％、約40％-75％、約50％-75％、約60％-75％或約25％-50％(w/w干重)的總非極性脂質含量，vi)所述細胞在植物的營養性部分中，并且包含至少約8％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、8％-75％、10％-75％、11％-75％、約15％-75％、約20％-75％、約30％-75％、約40％-75％、約50％-75％、約60％-75％或約25％-50％(w/w干重)的TAG含量，vii)所述轉錄因子多肽選自Wrinkled1(WRI1)、LeafyCotyledon1(LEC1)、LEC1樣、LeafyCotyledon2(LEC2)、BABYBOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4和Dof11，viii)油酸包含所述細胞中的總脂肪酸含量的至少20％(mol％)、至少22％(mol％)、至少30％(mol％)、至少40％(mol％)、至少50％(mol％)或至少60％(mol％)，優選約65％(mol％)或20％-約65％，ix)所述細胞中的非極性脂質包含脂肪酸，所述脂肪酸包含羥基、環氧基、環丙烷、雙碳-碳鍵、三碳-碳鍵、綴合的雙鍵、支鏈如甲基化或羥基化的支鏈，或者它們中兩種或更多種的組合，或者上述基團、鍵或支鏈中的任何兩種、三種、四種、五種或六種，x)所述細胞中的非極性脂質包含一種或多種多不飽和脂肪酸，其選自二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、或者它們中兩種或更多種的組合，xi)所述細胞在植物或其部分中，優選營養性植物部分，或者所述細胞是藻細胞如硅藻(硅藻類(bacillariophyte))、綠藻(綠藻類(chlorophyte))、藍綠藻(藍藻類(cyanophyte))、金褐藻(金藻類(chrysophyte))、定鞭藻類(haptophyte)、褐藻類和異鞭毛藻類，或者所述細胞來自或是適合發酵的生物體如真菌，xii)一種或多種或全部啟動子選自組織特異性啟動子如葉和/或莖特異性啟動子，發育調節啟動子如衰老特異性啟動子如SAG12啟動子，誘導型啟動子，或者晝夜節律調節啟動子，xiii)所述細胞包含總脂肪酸含量以及任選存在的編碼LPAAT的外源多核苷酸，所述總脂肪酸含量包含中鏈脂肪酸，優選C12:0、C14:0或兩者，水平為總脂肪酸含量的至少5％，所述LPAAT對具有中鏈長度(C8-C14)的脂肪酸，優選C12:0或C14:0，具有偏好活性，xiv)所述細胞包含這樣的總脂肪酸含量，相對于缺少外源多核苷酸和/或遺傳修飾的相應細胞，其油酸水平升高至少2％，和/或相對于缺少外源多核苷酸和/或遺傳修飾的相應細胞，其α-亞麻酸(ALA)水平降低至少2％，xv)相對于缺少外源多核苷酸和/或遺傳修飾的相應細胞中的非極性脂質，所述細胞中的非極性脂質包含修改水平的總甾醇，優選游離(非酯化的)甾醇、硬脂酰酯、硬脂酰糖苷，xvi)所述細胞中的非極性脂質包含蠟和/或蠟酯，xvii)所述細胞是至少約1000個這類細胞的群體或集合的成員之一，優選在營養性植物部分或種子中，xviii)所述細胞包含編碼沉默抑制子的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸可操作地連接至能夠指導所述多核苷酸在所述細胞中的表達的啟動子，xix)在重量基礎上，所述細胞的一種或多種非極性脂質和/或總非極性脂質含量的水平比包含編碼擬南芥WRI1(SEQIDNO:21)和擬南芥DGAT1(SEQIDNO:1)的外源多核苷酸的相應細胞高至少2％，以及xx)相對于缺少外源多核苷酸和/或遺傳修飾的相應細胞的總PUFA含量減少的總多不飽和脂肪酸(PUFA)含量。9.權利要求5-8中任一項的細胞，其中當相關時適用以下特性中的一種或多種或全部：i)參與一種或多種非極性脂質的生物合成的多肽是參與所述細胞中的TAG、DAG或單酰甘油(MAG)生物合成的脂肪酰基酰基轉移酶，如DGAT、PDAT、LPAAT、GPAT或MGAT，優選DGAT或PDAT，ii)參與所述細胞中的三酰甘油(TAG)分解代謝的多肽是SDP1脂肪酶、Cgi58多肽、酰基-CoA氧化酶如ACX1或ACX2、或者參與所述細胞中脂肪酸的β-氧化的多肽如PXA1過氧化物酶體ATP-結合盒轉運蛋白，優選SDP1脂肪酶，iii)所述油體包衣(OBC)多肽是油質蛋白，如聚油質蛋白或油體鈣蛋白，或者脂滴相關蛋白(LDAP)，iv)增加脂肪酸輸出所述細胞質體的多肽是C16或C18脂肪酸硫酯酶如FATA多肽或FATB多肽、脂肪酸轉運蛋白如...

【專利技術屬性】
技術研發人員：T·瓦赫克，J·R·皮特里，A·艾爾達吉，S·P·辛格，K·雷諾茲，柳青，B·A·萊塔，
申請(專利權)人：聯邦科學技術研究組織，
類型：發明
國別省市：澳大利亞,AU