一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞及其細(xì)胞亞群的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)建立了一種體外快速擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞及其功能性細(xì)胞亞群的方法。在常規(guī)培養(yǎng)擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中，增加TLR1/2激動(dòng)劑、TLR2/6激動(dòng)劑、TLR5激動(dòng)劑或聯(lián)合使用上述激動(dòng)劑可顯著提升CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增效率；此外，TLR激動(dòng)劑的使用可以使常規(guī)培養(yǎng)條件下難以擴(kuò)增的功能性CD8+T細(xì)胞亞群得以擴(kuò)增，如PD?1+CD8+T細(xì)胞、T

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞及其細(xì)胞亞群的方法
本專利技術(shù)屬細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞及其功能性細(xì)胞亞群的方法。
技術(shù)介紹
CD8+T細(xì)胞是參與抗腫瘤與抗感染免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，活化的CD8+T細(xì)胞可以迅速釋放高濃度的IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。在急性感染中，CD8+T細(xì)胞接受抗原刺激后，活化并大量增殖，分化成效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞（CTL），通過(guò)分泌穿孔素和顆粒酶（GranzymeB）殺傷被感染的細(xì)胞，或通過(guò)Fas-FasL通路誘導(dǎo)被感染的細(xì)胞凋亡。當(dāng)病原清除后，一小部分效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞分化成記憶性CD8+T細(xì)胞，當(dāng)相同抗原再次出現(xiàn)時(shí)，機(jī)體里的記憶性CD8+T細(xì)胞會(huì)迅速增殖、分化成為效應(yīng)CTL，進(jìn)而清除感染的病原體。CD8+T細(xì)胞也是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，通過(guò)疫苗主動(dòng)免疫誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤特異抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答是現(xiàn)代腫瘤免疫治療的發(fā)展方向之一。然而，在正常機(jī)體能激發(fā)有效的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的疫苗，在荷瘤機(jī)體中效果并不理想，這與多種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或因子在腫瘤局部高度富集或高表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤局部CD8+T細(xì)胞無(wú)能或耗竭進(jìn)而形成免疫抑制的微環(huán)境相關(guān)。腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TumorInfiltratingLymphocyte，TIL)是從腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原特異性CD4+T與CD8+T等淋巴細(xì)胞群，其中CD8+T細(xì)胞具有腫瘤殺傷作用。TIL在腫瘤周圍浸潤(rùn)的程度及CD8+T細(xì)胞所占的比例與腫瘤患者的良好預(yù)后呈明顯正相關(guān)。在慢性感染和腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，抗原特異性的CD8+T細(xì)胞由于受到抗原持久的刺激，不能有效分化成記憶性T細(xì)胞而逐步演變成功能紊亂的一群細(xì)胞，稱之為耗竭性CD8+T細(xì)胞。這群細(xì)胞表面持續(xù)性高表達(dá)PD-1抑制性受體，及CD244(2B4)，LAG-3，CD160，TIM-3，CTLA-4等抑制性受體。PD-1已被公認(rèn)為是耗竭性T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)：在慢性感染性疾病中，聯(lián)合阻斷PD-1與CTLA-4、PD-1與LAG-3、PD-1與Tim-3可部分恢復(fù)CD8+T細(xì)胞的生物學(xué)功能；對(duì)于腫瘤抗原特異性的CD8+T細(xì)胞，聯(lián)合阻斷PD-1和Tim-3，或PD-1和LAG-3，也同樣可部分恢復(fù)CD8+T細(xì)胞功能。盡管阻斷這些通路后可部分恢復(fù)耗竭性T細(xì)胞的功能，但未能使這些耗竭性T細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成非耗竭性T細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，不能達(dá)到根治的目的。最近RosenbergSA的研究表明：外周血中循環(huán)的PD1+CD8+T細(xì)胞能夠特異性識(shí)別黑色素瘤抗原，并且與腫瘤局部表達(dá)PD-1的腫瘤侵潤(rùn)的特異性CD8+T具有相似的T細(xì)胞抗原受體（Tcellreceptor,TCR），因此PD-1可以作為從外周血獲取腫瘤特異性T細(xì)胞的一個(gè)生物標(biāo)記。這為使用腫瘤特異性的淋巴細(xì)胞或TCR治療癌癥提供了新的非侵入性策略，并為發(fā)展個(gè)性化的治療提供新的方法。近幾年,免疫治療發(fā)展非常迅速,許多經(jīng)體外擴(kuò)增后回輸患者體內(nèi)的細(xì)胞療法,如CAR-T、DC-CIK、NKT、NK細(xì)胞等不斷涌現(xiàn)，相應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增方法也不斷的改進(jìn)和完善。目前擴(kuò)增患者細(xì)胞主要的技術(shù)是使用一種或多種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素IL-2、IL-17、IL-15配合抗CD3抗體以及CD28抗體刺激細(xì)胞的增殖。如將艾滋病患者或腫瘤患者體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞分離出來(lái)，用CD3抗體、IL-2和IL-7刺激記憶性CD8+T細(xì)胞的體外擴(kuò)增。與200IU/ml的IL-2相比，在TIL體外擴(kuò)增的培養(yǎng)體系中加入IL-15、IL-7各5ng/ml就可得到相同擴(kuò)增倍數(shù)和體外功能的TIL。IL-15與IL-7夠刺激T淋巴細(xì)胞的體外增殖，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，維持中央記憶性CD8+T細(xì)胞的表型，并減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+Treg）的數(shù)量，對(duì)腫瘤細(xì)胞能起到很好的控制作用。因此，低劑量IL-15與IL-7聯(lián)合使用可代替高劑量IL-2應(yīng)用于TIL的體外擴(kuò)增。黑素瘤TIL擴(kuò)增培養(yǎng)體系中加入抗CD3抗體后可顯著提高TIL擴(kuò)增倍數(shù)。然而，抗腫瘤免疫必備的特定功能性細(xì)胞亞群如PD-1+CD8+T細(xì)胞、TEMCD8+T細(xì)胞等，在常規(guī)培養(yǎng)條件下卻難以擴(kuò)增，迄今為止尚缺乏體外快速擴(kuò)增PD1+CD8+T細(xì)胞的方法。文獻(xiàn)報(bào)道從癌癥患者中分選的PD1+CD8+T細(xì)胞體外擴(kuò)增效率有限，而且擴(kuò)增出的細(xì)胞具有分泌IFN-γ的能力的一般不足20%，難以滿足抗腫瘤免疫與抗感染免疫的需求。如何進(jìn)一步提升CD8+T細(xì)胞及其PD1+CD8+T細(xì)胞亞群的擴(kuò)增效率、特別是有效擴(kuò)增功能性CD8+T細(xì)胞的能力，以增強(qiáng)抗感染和抗腫瘤療效是亟待解決的難題。因此，快速高效的擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞及其功能亞群并回輸至患者體內(nèi)，將是疾病治療的安全有效的方法，在保障技術(shù)安全性的同時(shí)，進(jìn)一步提升腫瘤治療的有效性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所解決的技術(shù)問(wèn)題是：建立一種CD8+T細(xì)胞及其功能性細(xì)胞亞群的擴(kuò)增方法，尤其是對(duì)被認(rèn)為是耗竭性的PD-1+CD8+T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的方法。通過(guò)添加Toll樣受體（Tolllikereceptor，TLR）激動(dòng)劑，如TLR1/2激動(dòng)劑、TLR2/6激動(dòng)劑、TLR5激動(dòng)劑或多種組合等，極大提升CD8+T細(xì)胞體外擴(kuò)增效率，并有效擴(kuò)增PD-1+CD8+T細(xì)胞等功能性細(xì)胞亞群。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案是：提供一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞及其功能性CD8+T細(xì)胞亞群的方法，在CD8+T細(xì)胞及功能性CD8+T細(xì)胞亞群培養(yǎng)體系中添加一種Toll樣受體激動(dòng)劑或聯(lián)合使用多種Toll樣受體激動(dòng)劑，配合抗人CD3抗體或抗人CD28抗體以及各種細(xì)胞因子刺激，能夠顯著提升CD8+T細(xì)胞及其功能性細(xì)胞亞群的擴(kuò)增效率與功能修復(fù)。其中，Toll樣受體激動(dòng)劑包括但不限于TLR1/2激動(dòng)劑、TLR2/6激動(dòng)劑、TLR5激動(dòng)劑，以及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9激動(dòng)劑，所述激動(dòng)劑可單獨(dú)使用，也可聯(lián)合使用。TLR1/2激動(dòng)劑包括但不限于Pam3CK4，TLR2/6激動(dòng)劑包括但不限于FSL-1與Pam2CGDPKHPKSF，TLR5激動(dòng)劑包括但不限于Flagellin。所述抗人CD3抗體或抗人CD28抗體包被于磁珠上進(jìn)行使用。所述抗人CD3抗體可單獨(dú)與TLR激動(dòng)劑聯(lián)合使用，也可與抗CD28抗組合后與TLR激動(dòng)劑聯(lián)合使用。所述細(xì)胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15，所述細(xì)胞因子可單獨(dú)使用，也可聯(lián)合使用，可同一時(shí)間加入培養(yǎng)，也可時(shí)間上先后加入培養(yǎng)體系。此外，所述功能性CD8+T細(xì)胞亞群為分選純化的PD-1+CD8+T細(xì)胞、分選純化的CD137+CD8+T細(xì)胞、分選純化的CD160+CD8+T細(xì)胞、分選純化的純真CD8+T細(xì)胞、分選純化的中央記憶型CD8+T細(xì)胞、分選純化的效應(yīng)記憶型CD8+T細(xì)胞、分選純化的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞、分選純化的過(guò)渡記憶型CD8+T細(xì)胞、分選純化的效應(yīng)干細(xì)胞CXCR5+CD8+T細(xì)胞、分選純化的組織記憶型CD8+T細(xì)胞。優(yōu)選的，對(duì)功能性CD8+T細(xì)胞亞群中的PD-1+CD8+T細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增時(shí)，需要抗人CD3抗體和抗CD28抗體在培養(yǎng)體系中持續(xù)存在以持續(xù)刺激該亞群的擴(kuò)增。體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞和PD-1+CD8+本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞及其功能性CD8+T細(xì)胞亞群的方法，其特征在于，在CD8+T細(xì)胞及功能性CD8+T細(xì)胞亞群培養(yǎng)體系中添加一種Toll樣受體激動(dòng)劑或聯(lián)合使用多種Toll樣受體激動(dòng)劑，配合抗人CD3抗體或抗人CD28抗體以及各種細(xì)胞因子刺激，能夠顯著提升CD8+T細(xì)胞及其功能性細(xì)胞亞群的擴(kuò)增效率與功能修復(fù)。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞及其功能性CD8+T細(xì)胞亞群的方法，其特征在于，在CD8+T細(xì)胞及功能性CD8+T細(xì)胞亞群培養(yǎng)體系中添加一種Toll樣受體激動(dòng)劑或聯(lián)合使用多種Toll樣受體激動(dòng)劑，配合抗人CD3抗體或抗人CD28抗體以及各種細(xì)胞因子刺激，能夠顯著提升CD8+T細(xì)胞及其功能性細(xì)胞亞群的擴(kuò)增效率與功能修復(fù)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，Toll樣受體激動(dòng)劑包括但不限于TLR1/2激動(dòng)劑、TLR2/6激動(dòng)劑、TLR5激動(dòng)劑，以及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9激動(dòng)劑，所述激動(dòng)劑可單獨(dú)使用，也可聯(lián)合使用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，所述TLR1/2激動(dòng)劑包括但不限于Pam3CK4，TLR2/6激動(dòng)劑包括但不限于FSL-1與Pam2CGDPKHPKSF，TLR5激動(dòng)劑包括但不限于Flagellin。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：所述抗人CD3抗體或抗人CD28抗體包被于磁珠上進(jìn)行使用。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：所述抗人CD3抗體可單獨(dú)與TLR激動(dòng)劑聯(lián)合使用，也可與抗CD28抗組合后與TLR激動(dòng)劑聯(lián)合使用。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：所述細(xì)胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15，所述細(xì)胞因子可單獨(dú)使用，也可聯(lián)合使用，可同一時(shí)間加入培養(yǎng)，也可時(shí)間上先后加入培養(yǎng)體系。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：所述功能性CD8+T細(xì)胞亞群為分選純化的PD-1+CD8+T細(xì)胞、分選純化的CD137+CD8+T細(xì)胞、分選純化的CD160+CD8+T細(xì)胞、分選純化的純真CD8+T細(xì)胞、分選純化的中央記憶型CD8+T細(xì)胞、分選純化的效應(yīng)記憶型CD8+T細(xì)胞、分選純化的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞、分選純化的過(guò)渡記憶型CD8+T細(xì)胞、分選純化的效應(yīng)干細(xì)胞CXCR5+CD8+T細(xì)胞、分選純化的組...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：徐建青，張曉燕，邱趁麗，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海市公共衛(wèi)生臨床中心，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海,31