提高測序準確性的方法技術

本發明專利技術提供了提高測序準確性的方法。例如，本發明專利技術的方法使用線性擴增來產生模板分子的相對較小的群體，其隨后可以擴增成DNA分子的較大的克隆群體以用于測序。

Methods to improve sequencing accuracy

The present invention provides methods for improving the accuracy of sequencing. For example, the method of the present invention uses linear amplification to produce relatively small groups of template molecules, which can then be amplified into larger clones of DNA molecules for sequencing.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】提高測序準確性的方法本專利技術提供了提高測序準確性的方法。例如，本專利技術的方法使用線性擴增從模板分子產生通常相對小的互補鏈群體，其中從特定模板產生的互補鏈彼此緊密接近保持，從而在分子與分子水平上校正錯誤。可以隨后將線性擴增的群體擴增成較大的DNA分子的克隆群體，例如通過指數擴增以進行測序。在克隆擴增方案中的第一次延伸期間，可能將錯誤引入DNA。圖1示出了第一延伸期間的誤摻入(misincorporation)錯誤的示意圖100。在該實例中，首先將DNA分子與表面結合的寡核苷酸雜交。雜交的寡核苷酸然后在稱為“第一延伸”的步驟中通過DNA聚合酶延伸。在該實例中，聚合酶在第一延伸步驟期間在特定位置處摻入不正確的核苷酸(誤摻入的堿基顯示為交叉/星)。在第一次延伸后，進行擴增步驟，其產生在第一次延伸期間生成的DNA分子的多個拷貝。在擴增期間，在第一延伸步驟期間引入的錯誤在作為克隆群體的部分的所有分子中傳播(propagate)。誤摻入的堿基將被測序為“高質量錯誤”，其可能難以與樣品中的真實突變區分開。在克隆擴增過程的第一或第二循環中產生的摻入錯誤在該特定位置被測序時產生混合信號。圖2示出了在第一擴增循環期間的誤摻入錯誤的示意圖200(誤摻入的堿基顯示為交叉/星)。在此早期階段時，克隆群體由兩種分子組成；一種分子具有正確的堿基，而另一種分子攜帶誤摻入的堿基。隨著克隆擴增過程繼續，這兩個分子用作模板以產生更多的DNA分子。最終的克隆群體可以由大約相等量的野生型和誤摻入的分子兩者組成，盡管隨機事件可能使比率偏斜。由分子的混合群體產生的混合信號產生“低質量”堿基識別(basecall)。誤摻入事件發生的時機(timing)(循環數)，連同在擴增的早期循環中發生的隨機效應，將影響存在于特定克隆群體中的野生型和突變體分子的比例。在一個實施方案中，本專利技術的方法可用于實質性減少或消除在第一延伸期間可能產生的高質量錯誤。在另一個實施方案中，本專利技術的方法還可以用于減少由在擴增的前幾個循環期間核苷酸的誤摻入引起的錯誤。根據本專利技術，提供了具有改善的準確性的測序方法，所述方法包括：提供核酸模板；通過線性擴增直接從所述模板核酸產生包含彼此緊密接近保持(retainedincloseproximitytoeachother)或可鑒定為從相同模板核酸獲得的多個互補寡核苷酸鏈的群體；并且對所述接近保持(saidproximityretained)(例如表面結合)的寡核苷酸實施測序反應。優選地，存在有至少三輪的線性擴增。通過具有最小數量的三輪線性擴增，與典型的指數擴增方法相比，任何引入的錯誤的影響將被稀釋。例如，如果我們假設從表面上的ssDNA鏈A開始，那么線性擴增僅在每輪中產生拷貝A’，而指數擴增在第一輪中產生A’，但然后在隨后的輪次中A和A’兩者，那么在第一輪產生A’中產生的錯誤將導致A’鏈在第1輪的100％錯誤(對于兩種擴增)，在第2輪的50％錯誤(對于兩種擴增)，但是然后在第3輪時，只有1/3的A’鏈在線性擴增中具有錯誤，但對于指數擴增，2/4的A’鏈具有錯誤。在這之后，使用指數擴增繼續產生具有錯誤的A’鏈的50％，而使用本方法，使用核酸模板的線性擴增，錯誤變得更稀釋。下面的實例顯示了用于線性擴增和指數擴增的錯誤傳播的比較，其中A和A’表示制備的鏈，并且粗體和下劃線表示含有突變的鏈。優選地，該方法還包括在線性擴增輪次之后且實施測序反應之前實施互補鏈群體的進一步(指數)擴增的步驟。任選地，包含通過線性擴增直接從模板核酸獲得的多個互補鏈的群體在它們結合到表面時保持彼此緊密接近。或者，包含通過線性擴增直接從模板核酸獲得的多個互補鏈的群體由于它們保持在防止或限制擴散的凝膠或乳液中而保持彼此緊密接近。優選地，提供多個核酸模板，并且產生多個互補鏈群體，其中每個群體直接自模板衍生，并且從每個模板衍生的群體衍生的成員保持彼此緊密接近。有利地，通過在克隆擴增之前通過特定表面結合文庫分子的線性擴增創建分子，由所述線性擴增創建的分子保持緊密接近。以這種方式的表面結合非常容易地導致進一步的測序步驟。自相同模板衍生的線性擴增分子群體的緊密接近保持也可以通過在線性擴增后雜交或附著擴增分子來實現，例如如果使用滾環擴增的話。緊密接近的保持還可以通過在凝膠或乳液內進行線性擴增循環以防止自由擴散來實現。這允許利用稀釋效應，使得任何誤摻入錯誤將被稀釋掉(因為通過線性擴增創建的互補鏈群體中的兩個分子將攜帶相同突變是極不可能的)。雖然完全在溶液中的線性擴增步驟(即，對于直接從相同核酸模板獲得的群體，沒有互補鏈的緊密接近保持)將降低總體錯誤率，但其仍然導致“高質量錯誤”得到維持(beingcarriedthrough)，因為此類情況下的誤摻入步驟(無論在溶液線性擴增步驟中還是在指數擴增步驟中)將導致攜帶突變的簇(cluster)。本方法允許區分由于延伸誤差所致的假象(artefacts)，因為它們(在表面結合或以其它方式接近保持或擴散受限)線性擴增期間被凝膠稀釋掉，而真實突變在樣品自身中。任選地，該方法包括將核酸模板附著到表面的步驟。這可以通過將所述核酸模板與位于表面上的第一引物雜交。或者，可以將模板核酸直接附著到表面。優選地，互補鏈群體的進一步擴增利用附著于表面的另外的擴增引物，所述另外的擴增引物不參與線性擴增步驟。任選地，(直接從核酸模板)線性擴增包括以下步驟：將所述核酸模板與第一引物雜交；延伸所述第一引物以產生所述模板的互補鏈；變性以釋放保持緊密接近的互補鏈(例如它保持結合于表面，因此完全不移動或在附近再雜交之前不擴散得較遠)；并且重復雜交和擴增步驟以產生直接從模板核酸獲得的表面結合互補鏈的群體。任選地，線性擴增可以使用重組酶聚合酶擴增(RPA)。任選地，線性擴增可以使用“WildfireTM”(LifeTechnologies)類型擴增，通過模板步行過程(templatewalkingprocess)制備模板鏈的線性拷貝。優選地，克隆擴增步驟是橋式擴增。優選地，該方法包括測序步驟。任選地，第一引物結合到固體支持物。優選地，固體支持物是平面元件。優選地，固體支持物是流動池。任選地，固體支持物是珠。或者，在附著于固體支持物的表面之前環化單鏈模板核酸，例如通過雜交進行。環化可以使用環連接酶(circligase)。滾環擴增(RCA)導致直接從模板核酸獲得的互補鏈的多聯體。優選地，然后將多聯體結合到固體支持物。優選地，固體支持物包含多個第二引物或其片段。第二引物的片段不具有足夠的大小以允許在線性擴增步驟中使用的條件下直接延伸。優選地，所述方法包括將反向互補寡核苷酸與第二引物片段雜交的步驟，其中所述反向互補寡核苷酸在其5’端包含作為全長第二引物序列的一部分的額外堿基。復制雜交的引物以延長表面引物，從而使它們適于進一步用于例如指數擴增。任選地，將第二引物或其片段接枝(graft)到附著點上。可以通過鏈霉抗生物素蛋白/生物素連接或通過鏈霉抗生物素蛋白/雙重生物素連接接枝。任選地，固體支持物上的僅約一半的接枝位點被第一引物占據。或者，可以存在偏斜比率(skewedratio)。任選地，可以通過寡核苷酸濃度，溫育時間和/或溫度來控制接枝過程。優選地，隨后將第二引物接枝到剩余的可用接本文檔來自技高網...

【技術保護點】
改善測序時的準確性的擴增方法，所述方法包括：提供核酸模板；通過線性擴增直接從所述模板核酸產生包含彼此緊密接近保持或可鑒定為從相同模板核酸獲得的多個互補寡核苷酸鏈的群體；并且對所述接近保持或可鑒定為從所述相同模板核酸獲得的寡核苷酸實施測序反應。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.14 GB 1410646.21.改善測序時的準確性的擴增方法，所述方法包括：提供核酸模板；通過線性擴增直接從所述模板核酸產生包含彼此緊密接近保持或可鑒定為從相同模板核酸獲得的多個互補寡核苷酸鏈的群體；并且對所述接近保持或可鑒定為從所述相同模板核酸獲得的寡核苷酸實施測序反應。2.如權利要求1中的方法，其中存在有至少三輪線性擴增。3.如權利要求1或2中的方法，其中所述方法還包括在所述線性擴增輪次后實施所述互補鏈群體的進一步指數擴增的步驟。4.如前述權利要求中任一項中的方法，其中通過線性擴增直接從所述模板核酸獲得的所述多個互補鏈(即，所述鏈群體)在它們與表面結合時保持彼此緊密接近。5.如權利要求1至3中任一項中的方法，其中通過線性擴增直接從所述模板核酸獲得的所述多個互補鏈(即，所述鏈群體)在它們保持在防止或限制擴散的凝膠或乳液中時保持彼此緊密接近。6.如前述權利要求中任一項中的方法，其中提供多個核酸模板，并且產生多個互補鏈群體，其中每個群體直接從模板衍生，并且從每個模板衍生的群體的成員保持彼此緊密接近。7.如前述權利要求中任一項中所述的方法，其中所述線性擴增包括以下步驟：將所述核酸模板與第一引物雜交；延伸所述第一引物以產生所述模板的互補鏈；變性以釋放保持緊密接近的互補鏈；并且重復雜交和擴增步驟以產生直接從所述模板核酸獲得的互補鏈群體。8.如權利要求3至7中的方法，其中所述互補鏈群體的進一步指數擴增是橋式擴增。9.如權利要求7或8任一項中的方法，其中將所述第一引物結合到所述表面。10.如前述權利要求任一項中的方法，其中所述表面是固體支持物。11.如前述權利要求任一項中的方法，其中所述表面是平面元件(planarelement)。12.如權利要求10或11任一項中的方法，其中所述固體支持物是流動池或珠。13.如前述權利要求任一項中的方法，其中在線性擴增之前環化所述核酸模板。14.如權利要求13中的方法，其中環化使用環連接酶(circligase)。15.如權利要求13或...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R里加蒂，JM鮑特爾，
申請(專利權)人：伊盧米納劍橋有限公司，
類型：發明
國別省市：英國,GB