將核酸包封在脂質納米粒主體中的方法技術

通過使一個或多個核酸流與一個或多個脂質流交匯產生了具有均勻小粒度的包封核酸納米粒。所述包封核酸納米粒包括包封在脂質納米粒主體內的核酸。通過使水性核酸流和在有機溶劑中的脂質流以高的線速度交匯且有機溶劑總濃度小于33％獲得了均勻的小粒度。

Method for encapsulating nucleic acids in lipid nanoparticle bodies

By encapsulating one or more nucleic acid streams with one or more lipid streams, encapsulated nucleic acid nanoparticles with uniform small size are produced. The encapsulated nucleic acid nanoparticles comprise nucleic acids encapsulated in the lipid nanoparticle bodies. Uniform particle size is achieved by bringing the aqueous nucleic acid flow and the lipid flow in the organic solvent at a high linear speed, and the total organic solvent concentration is less than 33%.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】將核酸包封在脂質納米粒主體中的方法專利
本專利技術通常涉及包封核酸納米粒組合物以及用于制備具有均勻的小粒度的包封核酸納米粒的方法和系統。專利技術背景向受治療者遞送生物活性劑(包括治療相關化合物)經常由于化合物到達靶細胞或組織的困難而受到阻礙。具體而言，將許多生物活性劑運輸到活細胞中受到細胞的復雜膜系統的高度限制。這些限制可導致需要使用比獲得結果所期望的那些高得多的濃度的生物活性劑，這增加了毒性作用和副作用的風險。一種解決該問題的方法是利用特定的載體分子和載體組合物，它們被允許選擇性進入細胞內。脂質載體、可生物降解的聚合物和各種綴合系統可用于改善生物活性劑向細胞的遞送。一類特別難于遞送到細胞的生物活性劑是生物治療劑(包括核苷、核苷酸、聚核苷酸、核酸和衍生物，例如mRNA和RNAi劑)。通常，核酸在細胞或血漿中僅能在有限的時間內保持穩定。RNA干擾、RNAi治療、mRNA治療、RNA藥物、反義治療和基因治療等的發展已經增加了將活性核酸試劑引入細胞中的有效方式的需求。為此，對于能夠穩定且遞送基于核酸的活性劑到細胞中的組合物是特別令人感興趣的。用于改善外源核酸向細胞內轉運的最充分研究的方法包括使用病毒載體或含陽離子脂質的制劑。病毒載體可用于將基因有效地傳遞到一些細胞類型中，但是它們通常不能用于將化學合成的分子引入到細胞中。一種供選的方法是使用引入了陽離子脂質的遞送組合物，其在一個部分與生物活性劑相互作用病情在另一個部分與膜系統相互作用。據報道，這類組合物根據組成和制備方法提供了脂質體、膠束、脂質復合物(lipoplexes)或脂質納米粒(綜述參見Felgner,1990,AdvancedDrugDeliveryReviews,5,162-187；Felgner,1993,J.LiposomeRes.,3,3-16；Gallas,2013,Chem.Soc.Rev.,42,7983-7997；Falsini,2013,J.Med.Chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；及其中參考文獻)。自從在1965年Bangham首次描述了脂質體(J.Mol.Biol.13,238-252)，對于開發用于遞送生物活性劑的基于脂質的載體系統存在持續的興趣和努力(Allen,2013,AdvancedDrugDeliveryReviews,65,36-48)。PhilipFelgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413-7417(1987)首次描述了通過采用帶正電荷的脂質體將功能性核酸引入培養細胞中的方法。K.L.Brigham等人,Am.J.Med.Sci.,298,278-281(1989)隨后在體內驗證了該方法。近來，已經開發了體外和體內具有驗證了的功效的脂質納米粒制劑(Falsini,2013,J.Med.Chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；Morrissey,2005,Nat.Biotech.,23,1002-1007；Zimmerman,2006,Nature,441,111-114.；Jayaraman,2012,Angew.Chem.Int.Ed.,51,8529-8533)。脂質制劑是很有吸引力的載體，因為它們能夠保護生物分子不被降解并同時提高它們的細胞攝取。在各種類型的脂質制劑中，含有陽離子脂質的制劑通常被用于遞送聚陰離子(例如核酸)。這類制劑可以使用單獨的陽離子脂質形成，任選地包括其它脂質和兩親物如磷脂酰乙醇胺。本領域熟知的是，脂質制劑的組成及其制備方法均影響所得聚集物的結構和尺寸(Leung,2012,J.PhysChem.C,116,18440-18450)。已經報道了多種技術將核酸包封在脂質納米粒中，包括洗滌劑透析、擠出、高速混合和逐步稀釋。然而，現有的核酸包封方法具有低包封率或不可規模化的問題，產生的納米粒缺乏高度均勻性，和/或不能獲得小于80nm平均粒度。因此，需要將核酸包封在脂質納米粒中的新方法，其產生了高包封度、可規模化并且產生了具有小于80nm的平均粒度的尺寸均勻的納米粒。專利技術簡述本專利技術涉及改善的將核酸包封在脂質納米粒主體(host)中的方法。該方法是可規模化的，并且提供了具有小的平均粒度(例如＜80nm)、改善的粒度均勻性和高的核酸包封度(例如>90％)的包封核酸納米粒的形成。通過本專利技術的方法產生的納米粒具有長期穩定性。本專利技術的第一個方面提供了將核酸包封在脂質納米粒主體中的方法，該方法通過將一個或多個脂質流與一個或多個核酸流合并和使所述合并流流動以得到包封核酸納米粒的第一出口溶液。每個脂質流包含一種或多種脂質在有機溶劑(例如乙醇)中的混合物。每個核酸流包含一種或多種核酸在水性溶液中的混合物。在脂質流和核酸流的交匯點，每種流都表征有線速度。所述一個或多個脂質納米粒流具有大于或等于約1.5米/秒的復合線速度。同樣，所述一個或多個核酸流具有大于或等于約1.5米/秒的復合線速度。在脂質流和核酸流合并和混合后，有機溶劑的最終濃度為使聚集最小的量(例如小于33％)。在一些實施方案中，第一出口溶液中有機溶劑的最終濃度為約20％至約25％。在第一個方面的一些實施方案中，將合并的脂質和核酸流用稀釋溶劑稀釋，以提供第一出口溶液。在第一個方面的其它實施方案中，合并的核酸流的復合線速度為約3至約14米/秒，脂質流的復合線速度為約1.5至約7米/秒。在本專利技術的第二個方面，所述第一出口溶液通過稀釋、培養、濃縮和透析進行進一步加工。在第二個方面的一些實施方案中，透析溶液也可以是無菌過濾的。通過第二個方面的方法產生的包封核酸納米粒具有長期穩定性。在本專利技術的第三個方面，通過本專利技術的方法產生的包封脂質納米粒具有小于約80nm的平均直徑。在一些實施方案中，納米粒具有約30至約80nM的平均直徑。在優選的實施方案中，納米粒具有小于約70nm(例如約40-70nm)的平均直徑。本專利技術的第四個方面提供了包封核酸納米粒組合物，其包含可藥用載體、脂質納米粒主體和核酸，其中所述包封核酸納米粒具有約40nm至約70nm的平均直徑。附圖簡述圖1圖解了用于制備和加工包封核酸納米粒的示例性方法的流程圖。圖2圖解了用于制備包封核酸納米粒的代表性系統。圖2a圖解了圖2的系統中使用的稀釋室的供選實施方案。圖3a、3b和3c圖解了圖2的系統中使用的混合室的供選實施方案。圖4a是低溫電子顯微鏡檢查得到的圖像，其圖解了采用十字形混合室和方法實施例2中所述的方法和物質產生的siRNA包封脂質納米粒的顆粒均勻性。圖4b是低溫電子顯微鏡檢查得到的圖像，其圖解了采用T-形混合室和方法實施例2中所述的方法和物質產生的siRNA包封脂質納米粒的顆粒均勻性。詳細說明1.0概述本專利技術提供了制備具有均勻的小粒度的包封核酸納米粒的方法。圖1顯示的是概括地描繪本專利技術的一個實施方案的步驟的代表性流程圖。在步驟100中，一個或多個脂質流在第一交匯點與一個或多個核酸流合并，得到第一合并流。然后，使第一合并流流動(步驟110)以允許所述合并流的各個流聯合，由此進行脂質納米粒組裝和核酸包封的過程。根據對初始核酸流所選擇的具體參數，合并流可以任選地用水性介質進一步稀釋(步驟120)，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
將核酸包封在脂質納米粒主體中以提供包封核酸納米粒的方法，該方法包括：提供一個或多個核酸流，所述一個或多個核酸流包含核酸在第一水性溶液中的混合物，并且具有大于或等于約1.5米/秒的復合線速度；提供一個或多個脂質流，所述一個或多個脂質流包含一種或多種脂質在有機溶劑中的混合物，并且具有大于或等于約1.5米/秒的復合線速度；將所述的一個或多個脂質流與所述的一個或多個核酸流在第一交匯點合并，得到第一合并流；使第一合并流以第一個方向流動并混合其組分，得到包含包封核酸納米粒的第一出口溶液；其中所述第一水性溶液和所述有機溶劑是可溶混的，所述第一水性溶液或所述有機溶劑中的一個含有緩沖液，并且所述第一出口溶液中的有機溶劑濃度小于33％。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.07.16 US 62/025,2241.將核酸包封在脂質納米粒主體中以提供包封核酸納米粒的方法，該方法包括：提供一個或多個核酸流，所述一個或多個核酸流包含核酸在第一水性溶液中的混合物，并且具有大于或等于約1.5米/秒的復合線速度；提供一個或多個脂質流，所述一個或多個脂質流包含一種或多種脂質在有機溶劑中的混合物，并且具有大于或等于約1.5米/秒的復合線速度；將所述的一個或多個脂質流與所述的一個或多個核酸流在第一交匯點合并，得到第一合并流；使第一合并流以第一個方向流動并混合其組分，得到包含包封核酸納米粒的第一出口溶液；其中所述第一水性溶液和所述有機溶劑是可溶混的，所述第一水性溶液或所述有機溶劑中的一個含有緩沖液，并且所述第一出口溶液中的有機溶劑濃度小于33％。2.權利要求1的方法，其中:所述第一水性溶液為包含堿金屬鹽水性溶液的第一緩沖溶液；和所述有機溶劑包含醇性溶劑。3.權利要求1或2的方法，還包括：用選自第二種緩沖溶液和水的稀釋溶劑稀釋所述第一合并流，得到第一出口流。4.權利要求3的方法，其中：所述堿金屬鹽選自NaCl和檸檬酸鈉中的一種或多種；和所述有機溶劑包含乙醇。5.權利要求1-4任一項的方法，其中：所述第一出口溶液中的有機溶劑濃度在約20至約25％之間。6.權利要求1-5任一項的方法，其中：所述一個或多個脂質流的復合線速度在約1.5至約4.5米/秒之間；和所述一個或多個核酸流的復合線速度在約3至約14米/秒之間。7.權利要求1或3-6任一項的方法，其中：所述一個或多個脂質流的復合線速度在約3至約4米/秒之間；和所述一個或多個核酸流的復合線速度在約9至約14米/秒之間。8.權利要求2-6任一項的方法，其中用稀釋溶劑稀釋所述第一合并流包括：提供稀釋流，所述稀釋流包含選自第二種緩沖溶液和水的水性溶劑；和將所述第一合并流與所述稀釋流合并，得到第一出口流；其中所述一個或多個脂質流的復合線速度在約3至約4米/秒之間；和所述一個或多個核酸流的復合線速度在約6至約8米/秒之間。9.權利要求1-8任一項的方法，還包括培養所述第一出口溶液。10.權利要求9的方法，還包括：用選自第三種緩沖溶液和水的第二稀釋溶劑稀釋經培養的第一出口溶液，得到第二出口溶液；和將所述第二出口溶液進行濃縮和透析。11.權利要求10的方法，其中所述濃縮...

【專利技術屬性】
技術研發人員：K·A·鮑曼，N·加德納，T·讓諾特，C·瓦熱塞，
申請(專利權)人：諾華股份有限公司，
類型：發明
國別省市：瑞士,CH