一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用，所述綠色熒光蛋白突變體以綠色熒光蛋白為母體，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突變?yōu)樽笮喟汀Ｔ摲椒ú僮骱?jiǎn)單，鋁離子檢測(cè)限可達(dá)μmol·L

Application of a green fluorescent protein mutant as an aluminum ion detection probe

The invention relates to a green fluorescent protein mutant as the application of aluminum ion detection probe, the green fluorescent protein mutant green fluorescent protein precursor, tyrosine in the amino acid sequence by directed mutation for levodopa. The method is simple and the detection limit of aluminum ion is up to mol L

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及鋁離子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
鋁是一種常見的金屬，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生活中。但由于食物鏈堆積、亂用濫用等原因，鋁元素極易以鋁離子地形式影響生態(tài)環(huán)境，甚至進(jìn)入人體內(nèi)，導(dǎo)致大腦神經(jīng)退化、記憶力衰退等。因此，對(duì)鋁離子在不同環(huán)境中的濃度檢測(cè)具有重要的意義。目前，與傳統(tǒng)的元素檢測(cè)法，如原子吸收法、原子發(fā)射法和電感耦合等離子體質(zhì)譜等方法相比，熒光探針檢測(cè)具有快速、便捷、靈敏度低等優(yōu)點(diǎn)。但是，目前報(bào)導(dǎo)的熒光探針通常都是通過(guò)有機(jī)全合成的手段獲得，制備過(guò)程繁瑣，而且在合成過(guò)程中使用了大量有機(jī)試劑、重金屬催化劑等。為了檢測(cè)某種金屬離子，卻在檢測(cè)過(guò)程中造成了二次污染，有違綠色化學(xué)原則。此外，在生物醫(yī)藥分析中，很多檢測(cè)均在活體中進(jìn)行，要求熒光探針具有高生物親和性，無(wú)毒無(wú)害、易于降解。綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是一種天然存在在于綠色熒光水母中的蛋白，由238個(gè)天然氨基酸構(gòu)成。經(jīng)過(guò)折疊后，其熒光生色團(tuán)被很好地包裹在11個(gè)β-折疊嵌段之中，形成桶裝結(jié)構(gòu)。其熒光發(fā)光穩(wěn)定，效率高，是一種高效的熒光探針。此外，由于蛋白獲取過(guò)程不涉及任何毒害物質(zhì)的使用，而且其生物相容性高，被廣泛地應(yīng)用在分子標(biāo)記、藥物篩選、抗體融合、生物傳感器等研究領(lǐng)域。Ayyadurai等人(Bioconjugatechemistry,2011,22(4):551-555.)在酪氨酸缺陷型大腸桿菌中培養(yǎng)得到了一種非天然氨基酸嵌入的綠色熒光蛋白(GFPdopa)，蛋白氨基酸序列中的酪氨酸被左旋多巴所替代。該研究對(duì)GFPdopa的性質(zhì)進(jìn)了研究，但是并未公開將其應(yīng)用于鋁離子的檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用，該方法操作簡(jiǎn)單，鋁離子檢測(cè)限可達(dá)μmol·L-1級(jí)，且選擇性高，滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需要。本專利技術(shù)所提供的技術(shù)方案為：一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用，所述綠色熒光蛋白突變體以綠色熒光蛋白為母體，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突變?yōu)樽笮喟汀Ｉ鲜黾夹g(shù)方案中，由于左旋多巴在水溶液體系中，對(duì)鋁離子有極高的親和性。因此當(dāng)綠色熒光蛋白生色團(tuán)中的酪氨酸被突變成左旋多巴后，生色團(tuán)可以與游離的鋁離子進(jìn)行配合，繼而產(chǎn)生熒光的變化。所述綠色熒光蛋白母體氨基酸序列已經(jīng)在Ayyadurai等(Bioconjugatechemistry,2011,22(4):551-555.)發(fā)表的文章中公開。所述綠色熒光蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1。所述綠色熒光蛋白是一種具有熒光生色團(tuán)的桶狀蛋白，可以在正常大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，其最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)在450～550nm之間，其紫外最大吸收峰在450～550nm之間。所述的綠色熒光蛋白突變體是在酪氨酸缺陷型大腸桿菌中表達(dá)；所述綠色熒光蛋白突變體氨基酸總數(shù)在為238(不包括Histag標(biāo)簽)，相對(duì)分子量在25000～30000道爾頓之間。作為優(yōu)選，所述綠色熒光蛋白突變體經(jīng)過(guò)透析、凍干后，分散到待測(cè)液中進(jìn)行檢測(cè)。作為優(yōu)選，所述檢測(cè)溫度為4～60℃，反應(yīng)時(shí)間在1～60min，待測(cè)液pH值為5～9。進(jìn)一步優(yōu)選，所述檢測(cè)溫度為15～40℃，反應(yīng)時(shí)間在1～10min，待測(cè)液pH值為6～8。作為優(yōu)選，所述待測(cè)液為實(shí)際污染液或者模擬緩沖液。作為優(yōu)選，所述實(shí)際污染液為被鋁離子污染的土壤浸出液或是被鋁離子污染的細(xì)胞培養(yǎng)液。作為優(yōu)選，所述模擬緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS)、2-N-嗎啡啉丙磺酸緩沖液(MES)、3-N-嗎啡啉丙磺酸緩沖液(MOPS)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(HEPES)或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl)。進(jìn)一步優(yōu)選為3-N-嗎啡啉丙磺酸緩沖液(MOPS)或4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(HEPES)。作為優(yōu)選，所述綠色熒光蛋白突變體在待測(cè)液中的添加量為1～10μmol·L-1。同現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果體現(xiàn)在：(1)本專利技術(shù)提供了一種全新的鋁離子檢測(cè)探針，制備過(guò)程綠色無(wú)污染，且探針?biāo)苄愿撸锵嗳菪院茫梢杂糜谏飿悠钒?xì)胞內(nèi)鋁離子濃度的檢測(cè)；(2)本專利技術(shù)所提供的探針選擇性高，在Na+,K+,Ag+,Ca2+,Mg2+,Ba2+,Zn2+,Cd3+,V3+等不同離子存在下，對(duì)鋁離子濃度均存在明顯響應(yīng)。具體實(shí)施方式以下應(yīng)用例可以使本專業(yè)人員更全面理解本專利技術(shù)，但不以任何方式限制本專利技術(shù)。綠色熒光蛋白突變體的表達(dá)綠色熒光蛋白突變體采用殘基特異性嵌入非天然氨基酸的手段進(jìn)行定向突變。將含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA的酪氨酸缺陷型大腸桿菌在基本培養(yǎng)基(Minimalmedium)中進(jìn)行培養(yǎng)，而后在含有左旋多巴的基本培養(yǎng)基中，在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。將完全表達(dá)后的大腸桿菌裂解，并在用鎳柱對(duì)裂解上清液進(jìn)行純化，其中發(fā)出黃綠色熒光的洗脫部分即為目標(biāo)蛋白。將蛋白溶液透析后再凍干即得到黃綠色固體即為綠色熒光蛋白突變體(GFPdopa)。鋁離子濃度的檢測(cè)是通過(guò)將探針與不同待測(cè)樣品混合后，通過(guò)熒光分光光度計(jì)計(jì)算熒光強(qiáng)度變化得到相應(yīng)鋁離子濃度。應(yīng)用例11、稱取0.14gGFPdopa蛋白固體溶于1LHEPES緩沖溶液(pH＝7.4)中作為檢測(cè)液(5μmol·L-1)。2、取適量硝酸鋁和硝酸鈉溶于HEPES緩沖溶液(pH＝7.4)，配成10、20、40、80μmol·L-1Al3+和50μmol·L-1Na+共存在的模擬污染液。3、將100μL檢測(cè)液分別與100μLHEPES緩沖液(空白對(duì)照)和100μL模擬污染液(待測(cè)液)混合搖勻后，靜置5min，控制檢測(cè)溫度為25℃時(shí)，用熒光分光廣度計(jì)檢測(cè)待測(cè)液熒光強(qiáng)度變化，根據(jù)擬合線性方程，計(jì)算得到Al3+濃度。結(jié)果表明，所述檢測(cè)探針可以檢測(cè)模擬污染液中鋁離子濃度，且不受Na+存在的干擾。應(yīng)用例21、稱取0.28gGFPdopa蛋白固體溶于1LHEPES緩沖溶液(pH＝7.0)中作為檢測(cè)液(10μmol·L-1)。2、取適量硝酸鋁和硝酸鉀溶于HEPES緩沖溶液(pH＝7.0)，配成10、20、40、80μmol·L-1Al3+和50μmol·L-1K+共存在的模擬污染液。3、將200μL檢測(cè)液分別與200μLHEPES緩沖液(空白對(duì)照)和200μL模擬污染液(待測(cè)液)混合搖勻后，靜置1min，控制檢測(cè)溫度為25℃時(shí)，用熒光分光廣度計(jì)檢測(cè)待測(cè)液熒光強(qiáng)度變化，根據(jù)擬合線性方程，計(jì)算得到Al3+濃度。結(jié)果表明，所述檢測(cè)探針可以檢測(cè)模擬污染液中鋁離子濃度，且不受K+存在的干擾。應(yīng)用例31、稱取0.14gGFPdopa蛋白固體溶于1LHEPES緩沖溶液(pH＝8.0)中作為檢測(cè)液(5μmol·L-1)。2、取適量硝酸鋁和硝酸銀溶于HEPES緩沖溶液(pH＝8.0)，配成10、20、40、80μmol·L-1Al3+和50μmol·L-1Ag+共存在的模擬污染液。3、將50μL檢測(cè)液分別與50μLHEPES緩沖液(空白對(duì)照)和50μL模擬污染液(待測(cè)液)混合搖勻后，靜置5min，控制檢測(cè)溫度為15℃時(shí)，用熒光分光廣度計(jì)檢測(cè)待測(cè)液熒光強(qiáng)度變化，根據(jù)擬合線性方程，計(jì)算得到Al3+濃度。結(jié)果表明，所述檢測(cè)探針本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用，其特征在于，所述綠色熒光蛋白突變體以綠色熒光蛋白為母體，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突變?yōu)樽笮喟汀?

【技術(shù)特征摘要】
1.一種綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用，其特征在于，所述綠色熒光蛋白突變體以綠色熒光蛋白為母體，其氨基酸序列中酪氨酸被定向突變?yōu)樽笮喟汀?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用，其特征在于，所述綠色熒光蛋白突變體經(jīng)過(guò)透析、凍干后，分散到待測(cè)液中進(jìn)行檢測(cè)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)溫度為4～60℃，反應(yīng)時(shí)間在1～60min，待測(cè)液pH值為5～9。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的綠色熒光蛋白突變體作為鋁離子檢測(cè)探針的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)溫度為15～40℃，反應(yīng)時(shí)間在1～10min，待測(cè)液pH值為6～8。5.根據(jù)權(quán)利要求2...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳迪，張麗鋒，方文軍，郭永勝，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：浙江,33