一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法技術

本發明專利技術公開了一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法，該方法包括以下步驟：挖取8～15cm長的木麻黃病根，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面；然后把其中一端的3～5cm浸泡于無菌水中，4～12h后，在木麻黃病根的另一端斷面流出乳白色的菌膿；用接種針挑取菌膿劃線培養于細菌培養基上，選擇分離出的典型單菌落進行擴大培養。所述木麻黃青枯菌溢出分離的方法具有操作容易，簡便快速，可靠性強，雜菌含量低的優點。

Method for overflowing and separating Casuarina solanacearum

The invention discloses a method for Casuarina R.solanacearum overflow separation, the method comprises the following steps: digging 8 ~ 15cm long Casuarina equisetifolia root cause, wash, cut into two flat and put fresh section; wherein one end of the 3 ~ 5cm soaked in sterile water, 4 ~ 12h, on the other end section the root cause of the outflow of Casuarina milk white pus bacteria; bacteria were inoculated with needle pus cultured in crossed bacterial culture medium, selection of typical single colonies were isolated from the expanding culture. The method for separating and separating the Ralstonia solanacearum of the Casuarina equisetifolia has the advantages of easy operation, simple and fast, high reliability and low content of miscellaneous bacteria.

【技術實現步驟摘要】
一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法
本專利技術屬于生物
，具體是涉及一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法。
技術介紹
目前木麻黃(Casuarina)青枯菌(Ralstoniasolanacearum)的分離一般采用植物細菌分離常規方法——稀釋分離法。稀釋分離法是植物細菌分離常規方法，長期以來應用于木麻黃青枯病菌的分離。其技術原理：自然條件下，木麻黃青枯菌從根系的根冠部位侵入，經細胞間隙侵入根系木質部的維管束，在根系維管束中大量繁殖、擴散，最終堵塞維管束中的液流運輸造成植株死亡，稀釋分離法取病根后，在無菌條件下清洗、剝去外皮均是為了避免雜菌污染，再將病根垂直于維管束將其切碎浸于水中，這時候生長于維管束中的青枯菌就會被釋放出來。TTC培養基由于含有2,2,3-三苯基四唑氯，能與青枯菌發生顯色反應，成為植物青枯病菌的選擇性培養基，即利用TTC培養基特異性區分青枯菌和其他細菌，并根據菌落生長形態來判斷其致病性的強弱。木麻黃青枯病菌稀釋分離法具體的操作是：挖取10～12cm木麻黃新鮮病根，在流水下刷洗，去除病根表面泥垢。在超凈工作臺上將病根剪成2～3cm長，75％的酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，剝去外皮，切除兩端，最后垂直維管束將其切碎，放入含有5～10ml無菌水的培養皿內30min，病菌從病根中釋放擴散到水中，形成懸浮液。用移植環蘸取菌液劃線培養于TTC培養基上，利用青枯菌對TTC培養基的顯色反應進行木麻黃青枯菌株的鑒定及毒性鑒別。上述稀釋分離法雖然長期運用于木麻黃青枯病菌的分離，但仍存在以下缺點：1.操作復雜。需要對病根表面進行清洗、消毒、剝皮、切碎、浸泡等一系列步驟程序才能完成。2.操作難度大。由于青枯菌生長繁殖于維管束組織中，需要橫切根系才能稀釋分離出病菌，但木麻黃根系木材密度大，細胞致密，切斷切碎根系費勁、費時；其次，根系外層樹皮含雜菌多，為保證分離效果需要將根系外皮剝除，外皮與根系木質部緊密連結，剝除過程操作難度大。3.雜菌含量較高，通常需要二次分離。有些病根維管束中含有較多腐生性菌或者分離過程操作不當，均會造成分離出的青枯菌中雜菌含量多，這時不能直接擴大培養，還應挑取典型菌落進行二次分離。4.利用TTC培養基傳統肉眼觀察判斷毒性菌株的方法可靠性較差。由于木麻黃青枯菌株混雜，菌系變異快，致病性分化嚴重，TTC培養基作為一種半選擇性培養基用于特異性區分青枯菌和其他細菌，并根據菌落生長形態來判斷其致病性的強弱存在誤差。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法，該方法具有操作簡單，分離成功率高，雜菌含量低的優點。其技術方案如下：一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法，包括以下步驟，(1)挖取8～15cm長的木麻黃病根，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面；(2)然后把其中一端的3～5cm浸泡于無菌水中，4～12h后，在木麻黃病根的另一端斷面流出乳白色的菌膿；(3)用接種針挑取菌膿劃線培養于細菌培養基上，選擇分離出的典型單菌落進行擴大培養。優選地，步驟(1)中，挖取的木麻黃病根10～12cm長，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面；步驟(2)中，浸泡6～8h。優選地，還包括對擴大培養的細菌進行16srRNA測序鑒定。更進一步地，所述6srRNA測序鑒定的擴增引物為：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。優選地，所述木麻黃病根為新近發病病株的病根，進一步地，其根系木質部呈透明水漬狀，淺褐色，植株地上部50～70％小枝黃化，稀疏、凋落的。本專利技術所述木麻黃青枯菌溢出分離方法具有以下優點：1.為木麻黃青枯菌的分離提供了一種新方法。2.操作步驟簡化：只需把病根一端浸泡于無菌水中就可以挑取菌膿，無需消毒，切根、剝皮等操作，提高工作效率。3.操作容易：只要將病根洗凈、兩端切出新鮮斷面，一端浸泡后就可得到新鮮菌膿。利用植物維管束毛細現象，病根浸泡時不用區分生理下端和生理上端，均能在另一端溢出乳白色至黃褐色的細菌膿液，簡單容易。4.對操作人員技術要求低：除了挑取菌膿，分離全過程無需在超凈工作臺上進行，無需具備熟練的無菌操作能力。5.雜菌含量低，通常無需二次培養，直接用于擴大培養。溢出的菌膿多為新鮮病菌，直接挑取，病菌活力強，分離成功率高，雜菌含量低。6.進一步地，利用16SrRNA基因檢測技術對分離出的青枯菌進行測序鑒定，大大提高了對分離出的青枯菌檢測和鑒定的可靠性。綜上所述，本專利技術利用木麻黃青枯菌入侵、繁殖及擴張特點，經過專利技術人長期的研究，在傳統木麻黃青枯菌稀釋分離法基礎上進行獨特的技術創新，專利技術了木麻黃青枯菌溢出分離法。與傳統稀釋分離方法相比，本專利所述的分離方法具有操作容易，簡便快速，可靠性強，雜菌含量低的優點，從而為木麻黃青枯菌的分離提出了一種新的有效方法。附圖說明圖1為部分菌株16SrRNA序列擴增電泳檢測結果；圖2為M-16SrRNA序列與GenBank中一種青枯菌16SrRNA序列的比較。具體實施方式自然條件下，木麻黃青枯菌從根系的根冠部位侵入，經細胞間隙侵入根系木質部的維管束并大量繁殖，在植株蒸騰作用下侵入的青枯菌隨著液流在導管及其鄰近組織內擴散，最終堵塞維管束中的液流運輸造成植株死亡。本專利技術利用溢出法能成功分離出青枯菌的原理在于：挖取的新近發病植株的病根，其維管束中不僅含有大量青枯菌，且維管束結構未遭徹底破壞，這些維管束就是植物體內的極細的毛細管，在毛細管作用下(毛細現象)它能把水分吸上來。將病根一端浸泡于水中后，維管束吸收水分，生長在維管束里面的青枯菌隨著液流向上運輸，最終會在病根另一端溢出青枯菌膿。所述木麻黃青枯菌溢出分離方法，包括挖取10～12cm長的木麻黃病根，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面，然后把其中一端3～5cm浸泡于無菌水中，6～8h后，在病根的另一端斷面會流出乳白色的菌膿。用接種針挑取菌膿劃線培養于細菌培養基上。選擇分離出的典型單菌落進行擴大培養并進行16srRNA測序鑒定。具體操作過程需要注意以下幾點：(1)挖取的病根為新近發病病株的根系，肉眼判斷標準為根系木質部呈透明水漬狀，淺褐色，植株地上部50～70％小枝黃化，稀疏、凋落。發病時間太長的病根木質部呈深褐色或黑褐色，植株地上部完全黃化干枯，這時病根內含腐生菌較多，分離時雜菌含量增多，有些病根甚至開始腐化，維管束結構遭到破壞，維管束的毛細管作用遭到破壞，不利于青枯菌膿的溢出；發病時間太短的病根則因為青枯菌繁殖數量不夠，也難于溢出青枯菌膿。(2)試驗室內浸泡病根時不用區分生理下端和生理上端。在自然狀態下青枯菌侵入根系維管束后隨著蒸騰液流在導管及其鄰近組織內繁殖擴散，但本專利技術利用的是植物維管束毛細管作用原理，維管束吸收水分，通過樹液的流動將青枯菌膿送到病根的另一端，因此無論病根的生理下端還是生理上端浸泡于水中，均能發生毛細現象，均能在另一端溢出乳白色至黃褐色的細菌膿液。(3)浸泡病根用無菌水，避免雜菌污染。本專利技術是利用維管束毛細管作用吸收水分，促進樹液流動，使生長在維管束中的青枯菌溢出。由于普通自來水中含有各種微生物，為了保證溢出青枯菌的純度，使用無菌水來浸泡病根為最佳。(4)及時挑取溢出的菌膿進行劃線培養。由于不同病株根系組織材質致密程度不同、感病時間長短不同或維管束中青枯菌含量不同等原因會造成病根溢出菌膿的速度不同，一旦溢本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)挖取8～15cm長的木麻黃病根，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面；(2)然后把其中一端的3～5cm浸泡于無菌水中，4～12h后，在木麻黃病根的另一端斷面流出乳白色的菌膿；(3)用接種針挑取菌膿劃線培養于細菌培養基上，選擇分離出的典型單菌落進行擴大培養。

【技術特征摘要】
1.一種木麻黃青枯菌溢出分離的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)挖取8～15cm長的木麻黃病根，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面；(2)然后把其中一端的3～5cm浸泡于無菌水中，4～12h后，在木麻黃病根的另一端斷面流出乳白色的菌膿；(3)用接種針挑取菌膿劃線培養于細菌培養基上，選擇分離出的典型單菌落進行擴大培養。2.根據權利要求1所述的木麻黃青枯菌溢出分離的方法，其特征在于，步驟(1)中，挖取的木麻黃病根10～12cm長，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面；步驟(2)中，浸泡6～8h。3.根據權利要求1所述的木麻黃青枯菌溢出分離的方法，其特征在于，還包括對擴大培養的細菌進行16srRNA測序鑒定。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：許秀玉，徐斌，王明懷，甘先華，張衛強，黃鈺輝，溫小瑩，周毅，郭樂東，黃芳芳，
申請(專利權)人：廣東省林業科學研究院，
類型：發明
國別省市：廣東,44