本實用新型專利技術提供一種用于外泌體分離、富集和檢測的微流體芯片，包括底板、頂板以及位于所述底板和頂板之間的檢測板，所述檢測板內設有液體檢測腔，所述液體檢測腔能夠將尿液中的外泌體收集于其中，并達到檢測的要求。本實用新型專利技術通過芯片收集后利用ELISA檢測方法進行檢測，可用于檢測尿液樣本或膀胱癌細胞系培養液上清中外泌體的含量，具有高度特異性的特點。本實用新型專利技術對排出人體之外的尿液進行收集，不會對人體造成任何影響或創傷，也不需要昂貴且精密的實驗儀器（如超速離心機、熒光顯微鏡），具有很大的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本技術屬于生物技術檢測領域，具體涉及開發一種集成尿液外泌體分離、富集及ELISA檢測的微流體芯片。
技術介紹
膀胱癌是指發生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤。是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。占我國泌尿生殖系腫瘤發病率的第一位，而在西方其發病率僅次于前列腺癌，居第2位。檢查方法包括尿常規檢查、尿脫落細胞學、尿腫瘤標記物、腹部和盆腔B超等檢查。根據上述檢查結果決定是否行膀胱鏡、靜脈尿路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等檢查明確診斷。其中，膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的最主要方法。然而膀胱鏡檢測費用高，并不適用于基層醫療單位或者貧困地區的普及應用，臨床上亟待尋找一種針對膀胱癌檢測的生物標志物來進行檢測。外泌體（exosomes）是一種直徑約為40-120nm，具有雙層質膜結構的囊泡，由細胞通過胞吐作用釋放至細胞外隙或生物學體液中。近年來，外泌體成為新的研究熱點，因其內包含來源細胞所特有的mRNAs、microRNAs及蛋白等多種信號分子，在信號傳導和免疫系統中起重要作用，并由完整的膜性結構包裹而減少微環境干擾，這使其在疾病診斷方面具有獨特的優越性，是研究生物標志物和進行腫瘤免疫的新的生物材料，同時也具有治療潛力。目前針對外泌體的研究主要分為分離技術和檢測技術。分離技術包括超速離心法、過濾離心法、密度梯度超速離心法、免疫磁珠結合超速離心法和色譜法等。檢測技術主要包括：掃描電子顯微鏡觀察形態（但SEM對樣品的預處理和制備上面要求較高，樣品的準備階段比較復雜，不適合對外泌體進行大量快速的測量，而且由于外泌體經過了預處理和制備過程，無法準確的進行外泌體濃度的測量）、動態光散射技術（但由于動態光散射技術是測量光強的波動數據，所以大顆粒的光強波動信號會掩蓋較小顆粒的光強波動信號，所以動態光散射不適合大小不一的復雜外泌體樣本的測量，只適合通過色譜法制備的大小均一的外泌體的尺寸測量，并且無法測量樣品中外泌體的濃度。）流式細胞儀檢測技術（流式細胞儀不僅可以檢測囊泡的大小、數量，而且通過熒光標記可以檢測囊泡的來源，將囊泡進行分類，因此，流式細胞儀是進行囊泡快速、高通量、多參數檢測的最優選擇。然而，傳統流式細胞儀針對的樣本主要是細胞，散射光的檢測極限通常是300-500nm，而大多數細胞外囊泡的直徑都在300nm以下，因此很難進行精確地定量和定性分析。）納米微粒追蹤分析技術（是一種比較新穎的研究納米顆粒的方法，可以直接和實時的觀測納米顆粒。由于外泌體表面有標志物CD9、CD63等跨膜蛋白的存在，在復雜的背景環境下(如血清中)，可以用熒光抗體標記外泌體，再用NTA的熒光測量功能實現在復雜背景下對外泌體的測量，但是需要精密的儀器）、流式細胞儀分析技術（但是流式細胞分析一次只能針對一個標志物進行檢測，外泌體太小，由目前的流式細胞儀設備檢測，有必要先綁定外來抗體包被的磁珠，需要精密的儀器設備，且操作繁瑣、敏感度各異）、免疫印跡檢測技術（操作過程復雜）和熒光定量PCR檢測分析microRNA（提取核酸步驟復雜，需要昂貴的實驗儀器）。因此，發展一種能夠可靠、快速、經濟地無創檢測外泌體尤其是膀胱癌患者來源的外泌體的方法非常必要。微流體芯片微流體芯片實驗室，是指把生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、生物與化學反應、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學反應過程，并對其產物進行分析的一種技術。是生命科學、化學科學與信息科學信號檢測和處理方法研究的重要技術平臺。具有集成性、分析速度快、高通量、能耗少、污染小、廉價、安全等特點。因此，構建一種集成外泌體分離、富集、檢測為一體的微流體芯片，擁有巨大的經濟效益。外泌體在尿液中可以穩定存在，尤其是尿液樣品可以在非創傷性損傷的前提下大量獲得。因此，如果能夠檢測尿液外泌體中的癌癥信息，則有望將其用于癌癥的無創診斷、監控等臨床應用。然而，實際上，由于單位體積尿液中的外泌體含量非常低，采用一般方法單次提取得到的外泌體，根本無法滿足后續檢測的要求，所以目前針對外泌體的檢測主要是先對樣本中的外泌體進行濃縮處理，之后再采取一定的表征測量。因此，本專利技術針對上述問題，研制了一種集成外泌體分離、富集和檢測為一體的微流體芯片，同時利用外泌體跨膜蛋白CD63這一特有的標志物，建立了一種芯片ELISA快速診斷方法。該方法在膀胱癌患者外泌體檢測、監測等方面具有一定的應用前景。
技術實現思路
本技術所要解決的技術問題是提供一種用于外泌體分離、富集和檢測的微流體芯片，通過該芯片，能夠對尿液中的外泌體進行分離、富集，并通過ELISA方法進行檢測，可有效檢測尿液中外泌體的量，檢測結果特異性強，實用性強。本技術解決技術問題所采用的技術方案是：一種用于外泌體分離、富集和檢測的微流體芯片，包括底板、頂板以及位于所述底板和頂板之間的檢測板，所述檢測板內設有液體檢測腔，所述液體檢測腔能夠將尿液中的外泌體收集于其中，并達到檢測的要求。在采用上述技術方案的同時，本技術可以采用或者組合采用以下進一步的技術方案：所述檢測板包括上層檢測板和下層檢測板，所述頂板上設有切割形成的注液孔和排液孔，所述注液孔上連接有注液管，所述排液孔上連接有排液管，所述上層檢測板和下層檢測板上分別設有進樣孔和廢液排出孔，所述注液孔與所述進樣孔的位置相對應，所述排液孔和所述廢液排出孔的位置相對應。所述頂板和所述上層檢測板之間通過第一雙面膠層固定粘貼在一起，所述第一雙面膠層上設有分別與所述注液孔和所述排液孔相對應的第一開孔，所述上層檢測板和所述下層檢測板之間設有兩層第二雙面，這兩層DSA雙面膠層上均設有分別與所述進樣孔和所述廢液排出孔對應的第二開孔，位于進樣孔下方的第二開孔之間粘附有孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片，位于廢液排出孔下方的第二開孔之間粘附有孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片。所述下層檢測板上設有連通所述進樣孔和所述廢液排出孔的第一通道。下層檢測板和所述底板之間設有第三雙面膠層，所述第三雙面膠層上設有分別與所述進樣孔和所述廢液排出孔對應的第三開孔，所述第三開孔之間設有與所述第一通道對應的第二通道。所述底板、頂板和上下層檢測板均為形狀大小一致的PMMA板。構成所述底板、頂板以及檢測板的PMMA板的長度為40mm，寬度為20mm，所述微流體芯片的整體厚度為6mm。所述第一雙面膠層、第二雙面膠層以及第三雙面膠層均為DSA雙面膠。所述注液管和所述排液管均為無菌軟管。所述注液孔和所述排液孔的孔徑均為1.8mm，所述進樣孔和所述廢液排出孔的孔徑均為10mm，所述注液孔與進樣孔同心設置，所述排液孔與所述廢液排出孔同心設置。本技術的有益效果是：本技術提供了一種用于集成外泌體分離、富集及檢測微流體芯片，通過芯片收集后利用ELISA檢測方法進行檢測，可用于檢測尿液樣本或膀胱癌細胞系培養液上清中外泌體的含量，具有高度特異性的特點。本技術對排出人體之外的尿液進行收集，不會對人體造成任何影響或創傷，也不需要昂貴且精密的實驗儀器（如超速離心機、熒光顯微鏡），具有很大的應用前景。附圖說明圖1是本技術的整體結構圖。圖2是本技術的整體結構爆炸圖。圖3是采用本技術的芯片進行檢測的結果比對圖，圖中以陰影線的疏密來本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于外泌體分離、富集和檢測的微流體芯片，其特征在于：包括底板（1）、頂板（2）以及位于所述底板和頂板之間的檢測板，所述檢測板內設有液體檢測腔，所述液體檢測腔能夠將尿液中的外泌體收集于其中，并達到檢測的要求。
【技術特征摘要】
1.一種用于外泌體分離、富集和檢測的微流體芯片，其特征在于：包括底板（1）、頂板（2）以及位于所述底板和頂板之間的檢測板，所述檢測板內設有液體檢測腔，所述液體檢測腔能夠將尿液中的外泌體收集于其中，并達到檢測的要求。2.如權利要求1所述的一種用于外泌體分離、富集和檢測的微流體芯片，其特征在于：所述檢測板包括上層檢測板（3）和下層檢測板（4），所述頂板（2）上設有切割形成的注液孔（5）和排液孔（12），所述注液孔（5）上連接有注液管（6），所述排液孔（12）上連接有排液管（13），所述上層檢測板（3）和下層檢測板（4）上分別設有進樣孔（7）和廢液排出孔（8），所述注液孔（5）與所述進樣孔（7）的位置相對應，所述排液孔（12）和所述廢液排出孔（8）的位置相對應。3.如權利要求2所述的一種用于外泌體分離、富集和檢測的微流體芯片，其特征在于：所述頂板（2）和所述上層檢測板（3）之間通過第一雙面膠層（9）固定粘貼在一起，所述第一雙面膠層（9）上設有分別與所述注液孔（5）和所述排液孔（12）相對應的第一開孔（14），所述上層檢測板（3）和所述下層檢測板（4）之間設有兩層第二雙面膠層（15），這兩層DSA雙面膠層（15）上均設有分別與所述進樣孔（7）和所述廢液排出孔（8）對應的第二開孔（16），位于進樣孔（7）下方的第二開孔（16）之間粘附有孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片（10），位于廢液排出孔（8）下方的第二開孔（16）之間粘附有孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片（17）。4.如權利要求3所述的一種用于外泌體分離、富集和檢測的微流體...
【專利技術屬性】
技術研發人員：梁利國，盛葉峰，孔夢奇，王書崎，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：新型
國別省市：浙江;33
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