基于代謝物及基因表達篩選三七皂苷合成關鍵基因的方法技術

本發明專利技術公開了一種基于代謝物及基因表達篩選三七皂苷合成關鍵基因的方法。具體的是采用高效液相色譜-質譜聯用系統對一年生三七不同部位的代謝物含量進行分析，同時利用熒光定量PCR技術對皂苷合成途徑關鍵酶基因表達量進行定量分析，通過典型關聯分析構建基因-代謝物相關圖，從而對關鍵基因進行篩選。本發明專利技術為進一步闡明三七中皂苷類物質合成機制提供了重要信息，同時為通過基因調控等手段提高三七皂苷含量提供了重要依據。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及三七中三萜皂苷合成途徑關鍵基因的篩選，具體的是結合一年生三七代謝物含量及三萜皂苷合成途徑關鍵基因的表達量進行典型關聯分析(canonicalcorrelationanalysis)，篩選出三七中對皂苷含量貢獻度較大的三萜皂苷合成途徑關鍵基因。
技術介紹
三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科人參屬植物，是我國傳統珍貴藥材，其主要生理活性成分為三七皂苷。三七的應用在古代主要作為金創要藥，用于體內外各種出血及跌打損傷、瘀滯腫痛的治療。現代藥理學研究表明三七總皂苷和部分單體皂苷在血液及心血管系統、系統代謝、免疫及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好的生理活性，其多方面的藥理作用及保健功能越來越受到人們的重視。目前三七皂苷的主要來源是從栽培三七提取得到的，然而三七為多年生草本植物，生長周期長，且生長條件苛刻、地理分布窄，加之病蟲害嚴重、連作障礙、農藥殘留等問題，其產量已難以滿足快速增長的市場需求。近年來，針對藥用植物次生代謝產物的基因調控已成為分子生物學研究的熱點，而皂苷類物質是植物次生代謝產物的重要組成部分，其含量和組成主要取決于生物合成關鍵基因在細胞中的表達水平。在植物細胞中，萜類化合物主要來源于兩個前體物質，異戊烯基焦磷酸(IPP)及其異構體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。細胞質中的甲羥戊酸(MVA)途徑和質體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑都能夠產生IPP和DMAPP，且兩條途徑所產生的IPP可以穿過質體膜互為對方所用。IPP分子和兩個DMAPP分子在法尼基焦磷酸合酶(FPS)的作用下生成法尼基焦磷酸(FPP)，兩個FPP分子在鯊烯合酶(SQS)的作用下以頭-頭方式還原偶聯生成三萜類物質的前體鯊烯。隨后，鯊烯在鯊烯環氧酶(SE)的作用下氧化成2，3-氧化鯊烯，達瑪烷二醇合成酶(DS)催化2，3-氧化鯊烯環化為達瑪烯二醇。達瑪烯二醇是達瑪烷型四環三萜皂苷類的骨架，在細胞色素P450單加氧酶及多種糖基轉移酶的作用下最終形成不同類型的達瑪烷型四環三萜皂苷。目前，植物三萜皂苷合成途徑中的一些關鍵酶基因已在人參屬植物中克隆和鑒定，研究證實它們的表達對三萜皂苷合成起著重要調控作用。此外，Niu等人對FPS，SS，SE和DS等基因在四年生三七開花期的表達進行了分析，為進一步闡明皂苷類物質在三七中的合成機制打下了基礎。本專利技術以探索三七中三萜皂苷合成關鍵酶基因表達水平和代謝物含量的關聯性為出發點，應用高效液相色譜-質譜聯用系統對一年生三七不同部位的代謝物含量進行了分析，同時利用熒光定量PCR技術對其皂苷合成途徑關鍵酶基因表達量進行定量分析，并且通過典型關聯分析構建了三七基因-代謝物相關圖，對關鍵基因進行了篩選。在本專利技術之前，尚未出現涉及基于三萜皂苷含量及其合成途徑關鍵基因表達量對三七三萜皂苷合成關鍵基因進行篩選的公開報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于構建三七生長發育早期皂苷合成關鍵基因和代謝物含量的關系網絡，篩選三七植物中對皂苷合成有重要作用的關鍵基因。為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供的技術方案包括下列步驟：1)分析一年生三七不同部位皂苷類物質代謝輪廓。2)測定皂苷合成途徑關鍵基因在三七不同部位的表達。3)構建基因-代謝物關系網絡，篩選三七中皂苷合成關鍵基因。上述方法中，所述三七不同部位為一年生三七的葉、葉柄及根部。步驟1)所述分析皂苷類物質代謝輪廓是采用高效液相色譜-質譜聯用系統對不同部位樣品甲醇提取物進行檢測，使用內標法通過標準曲線進行定量。分析方法參照Li等人“GlobalanalysisofchemicalconstituentsinShengmaiinjectionusinghighperformanceliquidchromatographycoupledwithtandemmassspectrometry”論文中報道的皂苷定量方法。步驟2)所述三七不同部位皂苷合成途徑關鍵基因的表達是采用熒光定量PCR(RT-Q-PCR)技術進行檢測的。具體是分別提取樣品RNA，再將RNA反轉錄合成第一鏈cDNA，以cDNA為模板，按照Takara公司SYBRPremixExTaqTM說明書中針對96實時熒光定量PCR儀推薦的方法進行設置。上述熒光定量PCR反應中的特異性引物具體序列參見表1。表1RT-Q-PCR中使用的基因引物序列所述實時熒光定量PCR檢測的反應條件為：95℃預變性2min，95℃變性10s，57℃退火15s，72℃延伸30s，45個循環。步驟3)中所述基因-代謝物關系網絡的構建和生物合成關鍵基因的篩選是通過典型關聯分析將三七皂苷含量與皂苷合成途徑關鍵基因表達量相結合分析得到的。具體的是使用皮爾遜相關系數對皂苷含量及皂苷合成途徑關鍵基因的表達量進行典型相關分析，變量相關系數高于0.5作為篩選關鍵合成基因的標準。本專利技術基于一年生三七中皂苷類物質代謝及皂苷合成途徑關鍵基因的表達構建了基因-代謝物關系網絡，對三七生長初期皂苷合成關鍵基因進行了篩選，為進一步闡明三七中皂苷類物質合成機制提供了重要信息，同時為通過基因調控等手段提高三七皂苷含量提供了重要依據。附圖說明圖1為三萜皂苷類物質在生物體內合成途徑；圖2為一年生三七不同部位皂苷類物質代謝輪廓譜圖，其中A是標準品混合溶液，B是一年生三七葉，C是一年生三七根，D是一年生三七葉柄；圖3為皂苷在不同部位分布及含量熱圖；圖4為一年生三七不同部位皂苷含量PCA分析圖，其中1是一年生三七根，2是一年生三七葉柄，3是一年生三七葉；圖5為皂苷合成途徑關鍵基因在一年生三七不同部位中的表達；圖6為一年生三七基因-代謝物關系網絡。具體實施方式下面對本專利技術的實施例作詳細說明，以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本專利技術，但不以任何形式限制本專利技術。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試劑如無特殊說明，均為市售購買產品。實施例1：代謝輪廓分析。1)材料與方法所用植物材料來自于本實驗室栽培三七，三七種子購于云南省文山州，于2013年12月播種于溫室，嚴格按照三七種植標準，保證三七生長環境的陰涼避光及適宜的溫濕度。于來年6月對一年生三七植株的葉、葉柄及根部分別取材，樣品經液氮速凍后，冷凍保存于-80℃冰箱。2)樣品提取將各樣品研磨成粉末，經48小時的冷凍干燥后用甲醇對樣品進行提取。準確稱量50mg樣品溶于1.5mL甲醇，渦旋本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于代謝物及基因表達篩選三七皂苷合成關鍵基因的方法，其特征在于包括如下步驟：(1)分析三七不同部位三萜皂苷類物質代謝輪廓；(2)分析皂苷合成途徑關鍵基因在三七不同部位的表達譜；(3)構建基因表達和皂苷的代謝相關圖，篩選出三七中皂苷合成關鍵基因。

【技術特征摘要】
1.一種基于代謝物及基因表達篩選三七皂苷合成關鍵基因的方法，其特征在于包括如
下步驟：
(1)分析三七不同部位三萜皂苷類物質代謝輪廓；
(2)分析皂苷合成途徑關鍵基因在三七不同部位的表達譜；
(3)構建基因表達和皂苷的代謝相關圖，篩選出三七中皂苷合成關鍵基因。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述代謝輪廓采用高效液相色譜-質譜聯
用系統進行，所述表達譜采用熒光定量PCR進行，所述相關圖采用典型關聯分析進行。
3.根據權利要求1所述的方法，所述不同部位包括：葉、葉柄及根。
4.根據權利要求1所述的方法，所述關鍵基因包括：法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鯊烯合酶
(SQS)、鯊烯環氧酶(SE)、達瑪烷二醇合成酶(DS)...

【專利技術屬性】
技術研發人員：齊煉文，陸續，王寧，李萍，
申請(專利權)人：中國藥科大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32