一株谷氨酸棒桿菌及其合成色氨酸的關鍵基因制造技術

本發明專利技術屬于微生物育種和發酵工程領域，具體涉及一株谷氨酸棒桿菌及其合成色氨酸的關鍵基因。所述高產菌株為是在谷氨酸棒桿菌CGMCC?No.12302的基礎上通過基因工程手段，對該菌株的基因組進行編輯，將色氨酸操縱子上trpDCB的突變位點整合到CGMCC?No.12302的基因組上得到的。本發明專利技術一方面為色氨酸合成有關基因提供了新的突變位點，為色氨酸的生物合成提供了新的研究方向；另一方面，通過搖瓶發酵發現，所得菌株的色氨酸產量約為原始的3.4倍，極大地提高了菌株產色氨酸的性能。

【技術實現步驟摘要】

：本專利技術屬于微生物育種和發酵工程領域，具體涉及發酵生產色氨酸的谷氨酸棒桿菌高產菌株的構建及其色氨酸合成有關基因trpD、trpC和trpB的突變位點。
技術介紹
：色氨酸是唯一有吲哚支鏈的芳香族氨基酸，化學名稱為2-氨基-3-吲哚基丙酸。色氨酸是人體所必需的8種氨基酸之一，其來源依靠食物供給，L-色氨酸主要有兩條去路，一條是合成蛋白質，另一條是進入分解代謝。L-色氨酸在其分解代謝過程中，會產生5-羥色氨酸、煙酸、松果體激素和黃尿酸等多種生理活性物質，這些生物活性物質有重要的醫藥用途；此外，L-色氨酸可以作為食品添加劑，調味劑和抗氧化防腐劑；近年來，在飼料中大量使用了甲硫氨酸和賴氨酸，色氨酸成為飼料中的主要限制性氨基酸，發現在飼料中加入少量的氨基酸就有很好的效果。因此L-色氨酸在醫藥、食品和飼料等方面有重要的工業價值。色氨酸的生產方法有蛋白水解提取法、化學合成法、酶催化法和微生物發酵法。蛋白水解法原料來源有限。化學合成需要高溫高壓，合成的是D-色氨酸和L-色氨酸的混合物，需要另外的精制過程。酶催化所用底物吲哚和絲氨酸價格昂貴，且酶本身也不安全。因此，前三種方法在工業生產中受到極大限制。目前微生物發酵法是色氨酸生產的主要方法。主要生產菌種為大腸桿菌，而大腸桿菌發酵過程易積累乙酸等副產物，嚴重抑制菌體生長、產酸水平和糖酸轉化率；另外，大腸桿菌產內毒素嚴重限制了產品的應用領域。谷氨酸棒桿菌為GRAS生物安全菌，為潛在的色氨酸生產菌種。谷氨酸棒狀桿菌在氨基酸發酵領域有著舉足輕重的地位，至今已經被安全應用了近60年。目前，包括谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等大多數氨基酸都是利用谷氨酸棒狀桿菌發酵生產。在谷氨酸棒桿菌中，由莽草酸途徑的中間物分支酸合成色氨酸的4個酶由6個基因組成的trpEGDCBA色氨酸操縱子編碼。trpE和trpG分別編碼鄰氨基苯甲酸合酶(ANS)的大小亞基，ANS催化分支酸到鄰氨基苯甲酸的第一步反應。trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉移酶(PRT)，trpC編碼雙功能酶磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶/吲哚-3-甘油磷酸合酶，trpB和trpA分別編碼色氨酸合酶(TS)的β鏈和α鏈。ANS受終產物色氨酸的強烈抑制，抑制50％酶活的色氨酸濃度為0.0015mM(Sugimoto和Shiio(1983).AgriculturalandBiologicalChemistry.47:2295–2305)。對PRT和TS的50％酶活抑制濃度分別為0.15mM(Sugimoto和Shiio(1983).AgriculturalandBiologicalChemistry.47:2295–2305)和7.7mM(Sugimoto和Shiio(1982).AgriculturalandBiologicalChemistry.46:2711–2718)。Matsui等通過5-氟色氨酸抗性選育的谷氨酸棒桿菌AJ12036編碼ANS大亞基的trpE基因上一個點突變使得絲氨酸密碼子(AGC)變為精氨酸密碼子(CGC)，相應多肽鏈上氨基酸的改變(Ser38Arg)導致ANS對色氨酸的反饋抑制不敏感(Matsui等(1987).JournalofBacteriology.109:5330–5332)。O’GARA和Dunican發現產生色氨酸的谷氨酸棒桿菌ATCC21850編碼PRT的trpD基因上兩個點突變，帶來多肽鏈上兩個氨基酸的改變(Ser149Phe，Ala162Glu)，導致PRT對色氨酸和5-甲基色氨酸具有更高的抗性(O’GARA和Dunican(1995).AppliedandEnvironmentalMicrobiology.61(12):4477–4479)。綜上所述，谷氨酸棒桿菌色氨酸操縱子編碼的酶受到終產物色氨酸的反饋抑制，成為限制利用谷氨酸棒桿菌高產色氨酸的重要因素，而目前有關解除色氨酸反饋調節的報道較少，相應菌株色氨酸生產水平也很低。只有日本研究者報道利用質粒過表達解除反饋抑制的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶、ANS和PRT，獲得了高產色氨酸的谷氨酸棒桿菌(Katsumata和Ikeda(1993).NatureBiotechnology.12:921–925；Ikeda和Katsumata(1999).AppliedandEnvironmentalMicrobiology.65(6):2497–2502)。然而，之后再沒有見到該菌株的相關報道，其中關鍵酶的突變位點也不清楚。因此，繼續選育解除色氨酸反饋抑制、得到產生色氨酸的谷氨酸棒桿菌就顯得十分必要。在前期工作中，我們通過誘變手段獲得了一株谷氨酸棒桿菌生產菌株，并申請了專利。此外，在進一步的誘變工作中，我們得到了一株谷氨酸棒桿菌，該菌株的色氨酸產量進一步提高，通過對色氨酸操縱子的測序發現了色氨酸操縱子trpD、trpC和trpB都發生了基因突變，推測trpDCB的突變可能部分解除了色氨酸對其所編碼酶的反饋抑制，從而提高了色氨酸的產量。為了驗證色氨酸產量的提高是由trpDCB的突變造成的，本專利技術以C.glutamicumTP607為出發菌株，對其基因組進行編輯，將發現的trpDCB的突變位點整合到C.glutamicumTP607的基因組上，得到了生產菌株C.glutamicumTP608，搖瓶發酵測定色氨酸的產量，發酵結果表明該菌株色氨酸產量大幅提升，進一步驗證了色氨酸產量的提高是由于trpDCB的突變部分解除了色氨酸對其所編碼酶的反饋抑制。
技術實現思路
：本專利技術的目的在于提供一株發酵生產色氨酸的谷氨酸棒桿菌高產菌株及其色氨酸合成有關基因trpD、trpC和trpB的突變位點。所述高產菌株為谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)TP608，是在谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)TP607(保藏編號CGMCCNo.12302)的基礎上通過基因工程手段，對該菌株的基因組進行編輯，將發現的色氨酸操縱子上trpDCB的突變位點整合到C.glutamicumTP607的基因組上得到的；trpDCB的突變位點具體如下：(1)將鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉移酶(PRT)的編碼基因trpD的第446位堿基C突變為T，使得所編碼的氨基酸由絲氨酸變成苯丙氨酸(Ser149Phe)；(2)將雙功能酶磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶/吲哚-3-甘油磷酸合酶的編碼基因trpC的第193位堿基C突變成T，使得所編碼的氨基酸由苯丙氨酸變成絲氨酸(Phe65Ser)；(3)將色氨酸合酶(TS)β鏈編碼基因trpB的第1076-1077位間增加了三個堿基ACG，第1079位的C突變為A，第1080位的A突變為G，導致丙氨酸突變成精氨酸(Ala360Arg)，同時增加了一個谷氨酸；上述序列對應序列表中的序列編號見表1；在本專利技術中采用如下定義：1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸殘基的公認IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認IUPAC命名法。2、突變體的標識采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示突變體中突變的氨基酸，如Ser149Phe，表示位置149位的氨基酸由Ser替換成Phe，位置的編號對應于突變前本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株發酵生產色氨酸的谷氨酸棒桿菌高產菌株，是在谷氨酸棒桿菌CGMCC?No.12302的基礎上通過基因工程手段對色氨酸操縱子上的trpD、trpC、trpB中至少一個進行改造獲得，其特征在于，所述菌株含有序列表SEQ?ID?No.4?6中的至少一個。

【技術特征摘要】
1.一株發酵生產色氨酸的谷氨酸棒桿菌高產菌株，是在谷氨酸棒桿菌CGMCCNo.12302的基礎上通過基因工程手段對色氨酸操縱子上的trpD、trpC、trpB中至少一個進行改造獲得，其特征在于，所述菌株含有序列表SEQIDNo.4-6中的至少一個。2.權利要求1所述的一株發酵生產色氨酸的谷氨酸棒桿菌高產菌株，其特征在于，所述菌株含有序列表SEQIDNo.4-6的三個序列。3.權利要求1所述的一株發酵生產色氨酸的谷氨酸棒桿菌高產菌株，其特征在于，所述SEQIDNo.4-6對應的氨基酸序列如SEQIDNo.10-12所示。4.權利要求1所述的一株發酵生產色氨酸的谷氨酸棒桿菌高產菌株，其特征在于，所述高產菌株的構建方法如下：(1)設計引物，通過重疊PCR獲得內含trpD、trpC、trpB突變位點的3個重疊片段trp1，trp2和trp3；(2)將重疊片段trp1，trp2和trp3分別與載體pK18mobsacB連接；(3)將所得質粒依次電轉化入CGMCCNo.12302電轉感受態中得高產菌株。5.權利要求1所述菌株在發酵...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李燕軍，陳寧，韓洪軍，袁啟發，高立棟，張順棠，李娟，謝希賢，張成林，徐慶陽，范曉光，馬倩，
申請(專利權)人：天津科技大學，蓮花健康產業集團股份有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12