抗CD33嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種抗CD33嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該抗CD33嵌合抗原受體包括依次串聯(lián)的CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、CD33單鏈抗體重鏈VL、Optimal?Linker?C、CD33單鏈抗體輕鏈VH、CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子，以及TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。此外，還公開了該抗CD33嵌合抗原受體的編碼基因、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)能顯著提高細(xì)胞因子的分泌、CAR?T細(xì)胞的體外殺傷作用，且臨床治療效果突出。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于腫瘤免疫治療
，具體涉及一種抗CD33嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達(dá)載體(尤其是一種基于復(fù)制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉(zhuǎn)基因載體)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)具有識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原、調(diào)控機(jī)體攻擊腫瘤細(xì)胞(高度特異性的細(xì)胞溶解)的能力。這個(gè)生物過程十分復(fù)雜，目前仍處于研究之中。上世紀(jì)90年代，多個(gè)科研小組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腫瘤抗原(tμmorantigens)，T淋巴細(xì)胞可以通過主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)依賴性方式識(shí)別這些腫瘤抗原。腫瘤免疫治療通常分為兩類，非特異性免疫和特異性免疫。非特異性免疫治療主要包括白細(xì)胞介素-2(interleμkin-2，IL-2)，干擾素α(interferonα，IFN-α)，腫瘤壞死因子(tμmornecrosisfactor，TNF-α)，卡介苗等細(xì)胞因子和毒素，過繼性細(xì)胞免疫治療等。特異性免疫治療主要是腫瘤疫苗。1.1腫瘤非特異性免疫治療非特異性免疫應(yīng)答是與生俱來的，它的形成并不需要抗原刺激，能廣泛地針對(duì)多種抗原，是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，但特異性不強(qiáng)，對(duì)某種特定抗原物質(zhì)往往不能產(chǎn)生足夠強(qiáng)度的反應(yīng)非特異性的免疫治療。在進(jìn)入臨床試驗(yàn)的多種細(xì)胞因子中，白細(xì)胞介素-2和干擾素應(yīng)用最為廣泛[RosenbergSA，LotzeMT，MμμlLM，etal.Aprogressreportonthetreatmentof157patientswithadvancedcancerμsinglymphokine-activatedkillercellsandinterleμkin-2orhigh-doseinterleμkin-2alone[J].NEnglJMed，1987，316(15):889－897.]。1.2腫瘤單克隆抗體的免疫治療近20多年來單克隆抗體已在腫瘤治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。抗腫瘤單抗藥物一般包括兩類：一是抗腫瘤單抗，二是抗腫瘤單抗偶聯(lián)物，或稱免疫偶聯(lián)物。免疫偶聯(lián)物分子由單抗與“彈頭”藥物兩部分組成，“彈頭”主要包括放射性核素、藥物和毒素，與單抗連接后分別構(gòu)成放射免疫偶聯(lián)物、化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免疫毒素。在1997年11月和1998年10月美國FDA分別通過了用于臨床腫瘤治療的兩個(gè)單抗—Ritμximab(ritμxan)和Trastμzμmab(herceptin)[DillmanRO.Magicbμlletsatlast！Finally—approvalofamonoclonalantibodyforthetreatmentofcancer[J].CancerBiotherRadiopharm，1997，12:223－225.]。目前認(rèn)為單抗的作用機(jī)制有阻斷作用、信號(hào)傳導(dǎo)作用以及靶向作用等三種作用機(jī)制，沒有直接的殺傷作用。另外還存在藥理學(xué)方面的問題，主要是到達(dá)腫瘤的藥量不足。由于偶聯(lián)物是異體蛋白，會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，有相當(dāng)數(shù)量將積聚于肝、脾和骨髓。偶聯(lián)物是大分子物質(zhì)，通過毛細(xì)血管內(nèi)皮層及穿透腫瘤細(xì)胞外間隙均受到限制。1.3腫瘤的過繼免疫治療腫瘤的過繼免疫治療是指將體外激活的自體或異體免疫效應(yīng)細(xì)胞輸注給患者，以殺傷患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。腫瘤過繼性免疫治療中的一個(gè)關(guān)鍵問題是尋找合適的腫瘤殺傷細(xì)胞。自上世紀(jì)80年代以來，包括LAK、細(xì)胞因誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-indμcedkillers，CIK)、TIL等細(xì)胞已先后應(yīng)用于臨床，但由于存在著擴(kuò)增倍速較低、細(xì)胞來源困難、細(xì)胞毒力不高等諸多問題，在臨床應(yīng)用上受到限制。如何提高T細(xì)胞的腫瘤抗原特異性具有重要的臨床意義。T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別主要是通過T細(xì)胞受體(Tcellreceptor，TCR)識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的人類白細(xì)胞抗原(hμmanleμkocyteantigen，HLA)-肽復(fù)合物，因此，T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原識(shí)別的特異性取決于T細(xì)胞表面的TCR。利用分子生物學(xué)的手段克隆腫瘤特異性T細(xì)胞的TCR，并通過構(gòu)建含TCR的病毒載體，把TCR轉(zhuǎn)入正常的T細(xì)胞中，使這些T細(xì)胞因攜帶腫瘤特異性而成為特異性腫瘤殺傷細(xì)胞[JohnsonLA，MorganRA，DμdleyME，etal.GenetherapywithhμmanandmoμseT-cellreceptorsmediatescancerregressionandtargetsnormaltissμesexpressingcognateantigen[J].Blood，2009，114(3):535－546.]。1.4腫瘤疫苗治療腫瘤疫苗治療是通過給患者體內(nèi)導(dǎo)入腫瘤抗原來激發(fā)患者的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。由于疫苗治療具有特異性、在體內(nèi)免疫效應(yīng)維持時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為研究熱點(diǎn)。近年來多肽疫苗、核酸疫苗、全蛋白疫苗、抗獨(dú)特性抗體疫苗、重組病毒疫苗、細(xì)菌疫苗、基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗、樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)疫苗等得到廣泛研究和應(yīng)用[RobbinsPF，MorganRA，F(xiàn)eldmanSA，etal.TμmorregressioninpatientswithmetastaticsynovialcellsarcomaandmelanomaμsinggeneticallyengineeredlymphocytesreactivewithNY-ESO-1[J].JClinOncol，2011，29(7):917－924.]。腫瘤疫苗治療的大規(guī)模應(yīng)用還有三個(gè)方面的問題亟待解決。首先，腫瘤相關(guān)抗原，每個(gè)腫瘤、每個(gè)亞型、每個(gè)腫瘤分期，這些相對(duì)抗原表達(dá)是不一樣的，所以選準(zhǔn)抗原，選準(zhǔn)病人人群是致關(guān)重要的。第二，如何達(dá)到腫瘤抗原在樹突狀細(xì)胞中髙效吸收與表達(dá)？抗原被樹突狀細(xì)胞吸收是以表面受體為介導(dǎo)的。樹突狀細(xì)胞有十幾個(gè)受體，如何根據(jù)特定的抗原選擇相應(yīng)的受體？第三，針對(duì)樹突狀細(xì)胞分化成熟的調(diào)控。樹突狀細(xì)胞的分化成熟是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，它既可走向激活T細(xì)胞也可以走向抑制T細(xì)胞。[靶向DC細(xì)胞的治療型腫瘤疫苗：亮點(diǎn)與挑戰(zhàn)并存。http://www.biodiscover.com/news/research/115794.html]1.5腫瘤CAR-T治療CAR-T，全稱是ChimericAntigenReceptorT-CellImmμnotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，結(jié)構(gòu)如圖1所示[EleanorJ.Cheadle,etal.CARTcells:drivingtheroadfromthelaboratoryt本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種抗CD33嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)的CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、CD33單鏈抗體重鏈VL、Optimal?Linker?C、CD33單鏈抗體輕鏈VH、CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子，以及TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種抗CD33嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)的CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、CD33單鏈抗
體重鏈VL、OptimalLinkerC、CD33單鏈抗體輕鏈VH、CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、
CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子，以及TCR嵌合受體T細(xì)胞激
活域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD33嵌合抗原受體，其特征在于：所述嵌合抗原受體的氨基
酸序列如SEQIDNO.50所示。
3.一種抗CD33嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)的CD8leader嵌合受體信號(hào)肽、CD33單鏈抗
體重鏈VL、OptimalLinkerC、CD33單鏈抗體輕鏈VH、CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、
CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD28嵌合受體共刺激因子、CD137嵌合受體共刺激因
子、以及TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗CD33嵌合抗原受體，其特征在于：所述嵌合抗原受體的氨基
酸序列如SEQIDNO.51所示。
5.編碼權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗CD33嵌合抗原受體的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.52或
SEQIDNO.53所示。
7.含有權(quán)利要求5或6所述的基因的重組表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載
體、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、腺病毒表達(dá)載體、腺相關(guān)病毒表達(dá)載體或質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述的慢病毒表達(dá)載體包含權(quán)利
要求5所述的基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述的慢病毒表達(dá)載體包括：用
于質(zhì)粒復(fù)制的原核復(fù)制子pUCOri序列；用于目的菌株大量擴(kuò)增的含氨芐青霉素抗性基因
AmpR序列；用于增強(qiáng)真核細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的病毒復(fù)制子SV40Ori序列；用于慢病毒包裝的慢病
毒包裝順式元件；用于真核細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的ZsGreen1綠色熒光蛋白；用于共同轉(zhuǎn)錄表
達(dá)蛋白質(zhì)的IRES核糖體結(jié)合序列；用于嵌合抗原受體基因的真核轉(zhuǎn)錄的人EF1α啟動(dòng)子；用
于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體的編碼基因；用于增
強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率的eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用
第二代慢病毒載體包括：慢病毒5terminalLTR、慢病毒3terminalSelf-...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：祁偉，俞磊，歐黃思，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31