一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒及檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒，包括反應(yīng)液1和反應(yīng)液2，所述反應(yīng)液1、反應(yīng)液2分別包括CYP2C19基因681位點(diǎn)和636位點(diǎn)的引物、探針，其681位點(diǎn)、636位點(diǎn)的引物序列如下：CYP2C19基因681位點(diǎn)：上游引物192FP：5’-ACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCT-3’；下游引物192RP：5’-ACTTTCTCCAAAATATCACTTTCCA-3’；CYP2C19基因636位點(diǎn)：上游引物193FP：5’-CGTTTCGATTATAAAGATCAGCAA-3’；下游引物193RP：5’-TTCTCAGGAAGCAAAAAACTTG-3’。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及PCR熒光探針技術(shù)，尤其涉及一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒及檢測方法。
技術(shù)介紹
細(xì)胞色素P450(CytochromeP450proteins，CYP)是一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白組成的結(jié)構(gòu)和功能相似，由超家族基因編碼的同工酶。它們是一類位于人細(xì)胞微粒體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的單加氧酶，參與催化內(nèi)源物質(zhì)，如甾體、膽汁酸、脂肪酸、生物源性氨類等的代謝，也代謝外源物質(zhì)包括大多數(shù)藥物。細(xì)胞色素P450廣泛分布于人體的各器官，主要分布在人的肝臟和腸道中。在細(xì)胞色素P450超家族中，主要由CYP1、2、3家族組成。在眾多CYP家族中，CYP2C家族是一個(gè)參與藥物代謝的重要家族，CYP2C19是CYP2C家族中的一個(gè)重要的酶，該酶由CYP2C19基因編碼。CYP2C19基因由9個(gè)外顯子組成，編碼基因長1473bp，編碼一個(gè)490個(gè)氨基酸組成的大小為56kDa的蛋白。目前，發(fā)現(xiàn)CYP2C19基因有至少14種突變基因和18種等位基因，最常見的突變有兩種，CYP2C19基因外顯子5的636位點(diǎn)突變和CYP2C19基因外顯子4的681位點(diǎn)的突變。而CYP2C19基因上的兩種等位基因突變CYP2C19*2－第5外顯子的G681A突變、CYP2C19*3－第4外顯子上的G636A突變(CYP2C19*1為野生型等位基因)導(dǎo)致酶失活，使不同個(gè)體分為六類藥物代謝基因類型，分別為CYP2C19*1/*1(快代謝型)、CYP2C19*1/*2(中等代謝型)、CYP2C19*1/*3(中等代謝型)、CYP2C19*2/*2(慢代謝型)、CYP2C19*3/*3(慢代謝型)、CYP2C19*2/*3(慢代謝型)。不同基因型個(gè)體對特定藥物的代謝速率不一樣，從而直接影響藥物療效和毒副作用的強(qiáng)弱。因此根據(jù)CYP2C19的基因型來指導(dǎo)準(zhǔn)確、安全用藥具有重要的臨床意義。目前檢測CYP2C19基因多態(tài)性的方法有多種，包括焦磷酸測序法、PCR-RFLP(聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性)、基因芯片法、熒光定量PCR法。焦磷酸測序法，結(jié)果準(zhǔn)確，但成本高耗時(shí)長；PCR-RFLP通過酶切電泳的方法檢測基因多態(tài)性，有成本低，結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)，但操作過程易受污染，導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤?；蛐酒ㄍㄟ^雜交原理檢測基因型，具有通量高的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是成本較高，操作繁瑣，結(jié)果難判讀。熒光定量PCR法具有操作簡單，耗時(shí)短，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的優(yōu)點(diǎn)，目前熒光定量PCR應(yīng)用于臨床檢查正受到越來越廣泛的使用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)使用2重TaqMan-MGB熒光探針PCR技術(shù)，利用特異性引物組和特異性探針組，在單管反應(yīng)中能檢測CYP2C19外顯子5的636位點(diǎn)基因多態(tài)性和/或CYP2C19外顯子4的681位點(diǎn)基因多態(tài)性，且檢測結(jié)果具有分辨率高、迅速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)的另一目的在于提供一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒的檢測方法。本專利技術(shù)是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒，所述試劑盒包括反應(yīng)液1和反應(yīng)液2，所述反應(yīng)液1、反應(yīng)液2分別包括CYP2C19基因681位點(diǎn)和636位點(diǎn)的引物、探針，其中，所述CYP2C19基因681位點(diǎn)、636位點(diǎn)的引物序列如下：CYP2C19基因681位點(diǎn)上游引物192FP：5’-ACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCT-3’；下游引物192RP：5’-ACTTTCTCCAAAATATCACTTTCCA-3’；CYP2C19基因636位點(diǎn)上游引物193FP：5’-CGTTTCGATTATAAAGATCAGCAA-3’；下游引物193RP：5’-TTCTCAGGAAGCAAAAAACTTG-3’。以及，一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：提取人全血基因組DNA和上述試劑盒；按比例將5μl人全血基因組DNA提取液加入40μl所述試劑盒的反應(yīng)體系中；PCR擴(kuò)增；結(jié)果判定。本專利技術(shù)提供的檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒，含有特異性引物組和特異性探針組，在單管反應(yīng)中能檢測CYP2C19外顯子5的636位點(diǎn)基因多態(tài)性和/或CYP2C19外顯子4的681位點(diǎn)基因多態(tài)性，且檢測結(jié)果分辨率高、迅速、準(zhǔn)確。本專利技術(shù)提供的檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒的檢測方法，具有操作簡單、迅速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1是本專利技術(shù)實(shí)施例8中CYP2C19的681位點(diǎn)GG純合野生樣本檢測結(jié)果圖；圖2是本專利技術(shù)實(shí)施例8中CYP2C19的681位點(diǎn)AA純合突變樣本檢測結(jié)果圖；圖3是本專利技術(shù)實(shí)施例8中CYP2C19的681位點(diǎn)GA雜合樣本檢測結(jié)果圖；圖4是本專利技術(shù)實(shí)施例8中CYP2C19的636位點(diǎn)GG純合野生樣本檢測結(jié)果圖；圖5是本專利技術(shù)實(shí)施例8中CYP2C19的636位點(diǎn)AA純合突變樣本檢測結(jié)果圖；圖6是本專利技術(shù)實(shí)施例8中CYP2C19的636位點(diǎn)GA雜合樣本檢測結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為了使本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本專利技術(shù)，并不用于限定本專利技術(shù)。為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本專利技術(shù)實(shí)施例提供了一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒，采用的技術(shù)原理是2重TaqMan-MGB熒光探針PCR法，根據(jù)待檢測位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物、野生型和突變型特異的TaqMan-MGB探針。TaqMan-MGB探針是在TaqMan探針的基礎(chǔ)上引入MGB修飾基團(tuán)，TaqMan探針兩端分別帶有熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，在正常狀態(tài)下，探針上的熒光被淬滅，不發(fā)出熒光。開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，探針被PCR酶水解，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)分離，有熒光信號釋放出來。而TaqMan-MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-FluorescentQuencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低探針本底信號的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團(tuán)，可以將探針的Tm值提高10℃左右。因此為了獲得同樣的Tm值，TaqMan-MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高，因?yàn)樵谀０宓腄NA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計(jì)。具體的，本專利技術(shù)實(shí)施例提供了一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒，所述試劑盒包括反應(yīng)液1和反應(yīng)液2，所述反應(yīng)液1、反應(yīng)液2分別包括CYP2C19基因681位點(diǎn)和636位點(diǎn)的引物、探針，其中，所述CYP2C19基因681位點(diǎn)、636位點(diǎn)的引物序列如下：CYP2C19基因681位點(diǎn)上游引物192FP：5’-ACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCT-3’；下游引物192RP：5’-ACTTTCTCCAAAATATCACTTTCCA-3’；CYP2C19基因636位點(diǎn)上游引物193FP：5’-CGTTTCGATTATAAAGATCAGCAA-3’；下游引物193RP：5’-TTCTCAGGAAGCAAAAAACTTG-3’。進(jìn)一步的，經(jīng)過專利技術(shù)人仔細(xì)研究，優(yōu)選下述具有特異性的探針系列，具體的，所述CYP2C19基因681位點(diǎn)、636位點(diǎn)的探針序列如下：CYP2C19基因681位點(diǎn)探針19本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括反應(yīng)液1和反應(yīng)液2，所述反應(yīng)液1、反應(yīng)液2分別包括CYP2C19基因681位點(diǎn)和636位點(diǎn)的引物、探針，其中，所述CYP2C19基因681位點(diǎn)、636位點(diǎn)的引物序列如下：CYP2C19基因681位點(diǎn)上游引物192FP：5’?ACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCT?3’；下游引物192RP：5’?ACTTTCTCCAAAATATCACTTTCCA?3’；CYP2C19基因636位點(diǎn)上游引物193FP：5’?CGTTTCGATTATAAAGATCAGCAA?3’；下游引物193RP：5’?TTCTCAGGAAGCAAAAAACTTG?3’。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括反應(yīng)液1和反應(yīng)液2，所述反應(yīng)液1、反應(yīng)液2分別包括CYP2C19基因681位點(diǎn)和636位點(diǎn)的引物、探針，其中，所述CYP2C19基因681位點(diǎn)、636位點(diǎn)的引物序列如下：CYP2C19基因681位點(diǎn)上游引物192FP：5’-ACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCT-3’；下游引物192RP：5’-ACTTTCTCCAAAATATCACTTTCCA-3’；CYP2C19基因636位點(diǎn)上游引物193FP：5’-CGTTTCGATTATAAAGATCAGCAA-3’；下游引物193RP：5’-TTCTCAGGAAGCAAAAAACTTG-3’。2.如權(quán)利要求1所述的檢測人CYP2C19基因分型的試劑盒，其特征在于，所述CYP2C19基因681位點(diǎn)、636位點(diǎn)的探針序列如下：CYP2C19基因681位點(diǎn)探針192G：5’-CATTGATTATTTCCCGGGAA-3’；探針192A：5’-CCACTATCATTGATTATTTCCCAGG-3’；CYP2C19基因636位點(diǎn)探針193G：5’-CCCCTGGATCCAGGT-3’；探針193A：5’-CCCCCTGAATCCA-3’；所述探針5’端采用FAM、HEX、TET、VIC、ROX、CY5、CY3、JOE、ALEX、CAL、Fluor熒光基團(tuán)中的一種進(jìn)行標(biāo)記，所述探針3’端無熒光基團(tuán)，連接MGB基團(tuán)。3.如權(quán)利要求1所述的檢測人CYP2C19...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：譚愛女，羅曉騰，郭永超，
申請(專利權(quán))人：深圳聯(lián)合醫(yī)學(xué)科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44