一種檢測大分子水產膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法技術

本發明專利技術提供一種檢測大分子水產膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法，所述PCR引物分別為COD?ID?NO：1&COD?ID?NO：2或TIL?ID?NO：1&TIL?ID?NO：2或RAF?ID?NO：1&RAF?ID?NO：2；所述檢測方法是將提取的水產膠原蛋白的DNA模板進行PCR擴增，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定；本發明專利技術根據三種魚類線粒體保守基因12SrRNA設計了大量引物，從中選取出了可對不同種類水產膠原蛋白進行有效檢測的引物，通過PCR擴增及凝膠電泳檢測，進行水產膠原蛋白的鑒定，其檢測方法具有高特異性，高靈敏度以及實用性的特點，能夠有效的對水產膠原蛋白物種來源進行檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物檢測領域，尤其是一種檢測大分子水產膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法。
技術介紹
膠原蛋白原本指的是生物體內細胞外基質(ECM)的一類結構蛋白質，是一類外觀呈白色、不透明、沒有支鏈的纖維型蛋白質，它在生物體內作為一種重要的功能性蛋白質，在細胞再生、保證皮膚、骨骼發揮正常功能中有著重要作用，同時也與細胞分化、細胞衰老、關節潤滑及疾病產生息息相關。目前，市售膠原蛋白主要來源于陸源性畜禽(豬、牛等)皮骨、淡水魚魚皮、魚鱗以及深海魚皮等，而水產膠原蛋白因其優良的理化特性和生理活性功能，漸漸成為市售膠原蛋白主要來源，也逐漸被人們所認可。隨著膠原蛋白在市場上的流通，膠原蛋白的品質及其來源也成為人們關注的熱點：最初對于膠原蛋白產品的鑒定，大都通過外觀、氣味進行觀察識別，但此方法準確性較差，檢測的結果并不可靠，不值得提倡。進一步的，膠原蛋白產品的鑒別采用理化鑒定方法，如鈣鹽沉淀法以及鹽酸部分水解法等，這類鑒別方法同樣存在弊端：準確性差、重復性低，可操作不強等，未能得到很好的使用。PCR技術自專利技術以來被廣泛證明具有高特異性，高靈敏度的特點，在鑒定物種來源中發揮著重要作用。本專利技術所參考序列線粒體基因組具有種內高度保守性，特別是線粒體12SrRNA基因具有抗腐蝕以及耐高溫的特點，廣泛被應用于牛肉、豬肉及其制品、其他肉類加工制品以及飼料的檢測。本專利技術利用水產品的線粒體——12SrRNA基因進行測定與鑒別，以期為水產膠原蛋白的檢測提供有效的分子標記系統，實現膠原蛋白類制品行業的規范化、標準化以及國際化。
技術實現思路
為了實現對市售水產膠原蛋白產品的鑒別，同時也為魚皮魚鱗膠原產品質量控制、膠原蛋白類藥物的質量控制以及含膠原生物材料、醫療器械、生化材料質量控制提供理論依據與技術借鑒，實現膠原蛋白類制品行業的規范化、標準化以及國際化，本專利技術提出了一種檢測大分子水產膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法，其技術方案如下：一種檢測大分子水產膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法，其特征在于：所述PCR引物分別為CODIDNO：1&CODIDNO：2或TILIDNO：1&TILIDNO：2或RAFIDNO：1&RAFIDNO：2；其中，所述引物上下游核苷酸序列分別為：CODIDNO：1ACCTCCGATTCCACGAAAGCODIDNO：2ACGCTACACCTCGACCTGACTILIDNO：1GGCTTGGTCCTGACTTTACTGTILIDNO：2CCTGATACCGGCTCCTTGTTRAFIDNO：1AGCCCTAAACCCAGATGTCCRAFIDNO：2AGCCCATTTCTTCCCACTTC所述檢測方法包括以下步驟：(1)對膠原蛋白樣本進行預處理，直至膠原蛋白粉末被完全消化；(2)提取膠原蛋白樣本中的DNA作為核苷酸檢測的模板；(3)將樣本中所提取的DNA模板進行PCR擴增；(4)將擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并確定產物的目標條帶。進一步的，所述步驟(3)中PCR反應程序為94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環，72℃延伸10min；所述PCR反應體系包括樣本DNA1ul，2×TapPCRMasterMix12.5ul，ddH2O9.5ul，上下游引物各1ul。進一步的，所述步驟(3)設置陰性對照，所述陰性對照組為去離子水。進一步的，所述樣本DNA由DNA提取試劑盒提取獲得。本專利技術與現有技術相比，有如下優點：本專利技術根據三種魚類線粒體保守基因12srRNA設計了大量引物，從中選取出了可對不同種類水產膠原蛋白進行有效檢測的引物，與樣本DNA進行PCR擴增生成特異性的基因片段，之后通過瓊脂糖凝膠電泳過程得出樣品鑒定的結果，其檢測方法具有高特異性，高靈敏度以及實用性的特點，能夠有效的對水產膠原蛋白物種來源進行檢測。樣品DNA由深加工食品DNA提取試劑盒DNeasymericonFoodKit(德國Qiagen公司)提取獲得，操作過程嚴格依據試劑盒說明書進行，保證獲取足夠的DNA量進行聚合酶鏈式反應。本專利技術檢測方法具有高特異性、高靈敏度的特點，現已在鑒定物種來源中發揮著重要作用，檢測的結果精確可靠。同時，本專利技術的引物序列經過本領域相關軟件DNAman、PrimerPremier6.0、Oligo7設計獲得，三對引物分別對各自物種的12SrDNA片段進行擴增，不會擴增該物種的其它區域以及其它物種的DNA序列，其引物干粉可通過化學合成方法獲得。附圖說明圖1為PCR擴增產物的凝膠電泳圖譜。其中，圖a為羅非魚膠原蛋白檢測結果，圖b為鱈魚膠原蛋白檢測圖譜，圖c為斑點叉尾鮰膠原蛋白檢測圖譜。樣品順序為：M-分子量Marker；1-豬膠原蛋白；2-鱈魚膠原蛋白；3-羅非魚膠原蛋白；4-牛膠原蛋白；5-斑點叉尾鮰膠原蛋白；6-水。具體實施方式下面結合附圖1對本專利技術做詳細說明，如圖1所示，一種檢測大分子水產膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法，其特征在于：所述PCR引物分別為CODIDNO：1&CODIDNO：2或TILIDNO：1&TILIDNO：2或RAFIDNO：1&RAFIDNO：2；其中，所述引物上下游核苷酸序列分別為：CODIDNO：1ACCTCCGATTCCACGAAAGCODIDNO：2ACGCTACACCTCGACCTGACTILIDNO：1GGCTTGGTCCTGACTTTACTGTILIDNO：2CCTGATACCGGCTCCTTGTTRAFIDNO：1AGCCCTAAACCCAGATGTCCRAFIDNO：2AGCCCATTTCTTCCCACTTC所述檢測方法包括以下步驟：(1)對膠原蛋白樣本進行預處理，直至膠原蛋白粉末被完全消化；(2)提取膠原蛋白樣本中的DNA作為核苷酸檢測的模板；(3)將樣本中所提取的DNA模板進行PCR擴增；(4)將擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并確定產物的目標條帶。其中，樣品DNA樣品由深加工食品DNA提取試劑盒DNeasymericonFoodKit(德國Qiagen公司)提取獲得，操作過程嚴格依據試劑盒說明書進行，保證獲取足夠的DNA量進行聚合酶鏈式反應，在此基礎上再對其進行PCR擴增及電泳檢測。所述步驟(3)中PCR反應程序為：在94℃條件下進行預變性5min，接著94℃條件下變性30s，然后55℃條件下退火30s，再72℃條件下延伸1min，一共進行30個循環，最后在72℃條件下延伸10min；所述PCR反應體系包括樣本DNA1ul，2×TapPCRMasterMix12.5ul，ddH2O9.5ul，上下游引物各1ul。作為優選方案，所述步驟(3)設置陰性對照，所述陰性對照組為去離子水。作為優先方案，所述樣本DNA由DNA提取試劑盒提取獲得。實施例1：羅非魚膠原蛋白檢測(1)DNA提取：取羅非魚膠原蛋白樣品2g，使用DNeasymericonFoodKit試劑盒或者同類型食品深加工DNA提取試劑盒進行DNA提取。提取過程中的操作要嚴格依據試劑盒說明書進行，保證獲取足夠的DNA量進行聚合酶鏈式反應，在此基礎上再對其進行PCR擴增及電泳檢測。(2)PCR擴增：建立25ulPCR本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測大分子水產膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法，其特征在于：利用引物與水產膠原蛋白中提取的DNA進行擴增，生成特異性片段；所述PCR引物分別為COD?ID?NO：1&COD?ID?NO：2或TIL?ID?NO：1&TIL?ID?NO：2或RAF?ID?NO：1&RAF?ID?NO：2；其中，所述引物上下游核苷酸序列分別為：COD?ID?NO：1ACCTCCGATTCCACGAAAGCOD?ID?NO：2ACGCTACACCTCGACCTGACTIL?ID?NO：1GGCTTGGTCCTGACTTTACTGTIL?ID?NO：2CCTGATACCGGCTCCTTGTTRAF?ID?NO：1AGCCCTAAACCCAGATGTCCRAF?ID?NO：2AGCCCATTTCTTCCCACTTC所述檢測方法包括以下步驟：(1)對膠原蛋白樣本進行預處理，直至膠原蛋白粉末被完全消化；(2)提取膠原蛋白樣本中的DNA作為核苷酸檢測的模板；(3)將樣本中所提取的DNA模板進行PCR擴增；(4)將擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并確定產物的目標條帶。

【技術特征摘要】
1.一種檢測大分子水產膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法，其特征在于：利用引物與水產膠原蛋白中提取的DNA進行擴增，生成特異性片段；所述PCR引物分別為CODIDNO：1&CODIDNO：2或TILIDNO：1&TILIDNO：2或RAFIDNO：1&RAFIDNO：2；其中，所述引物上下游核苷酸序列分別為：CODIDNO：1ACCTCCGATTCCACGAAAGCODIDNO：2ACGCTACACCTCGACCTGACTILIDNO：1GGCTTGGTCCTGACTTTACTGTILIDNO：2CCTGATACCGGCTCCTTGTTRAFIDNO：1AGCCCTAAACCCAGATGTCCRAFIDNO：2AGCCCATTTCTTCCCACTTC所述檢測方法包括以下步驟：(1)對膠原蛋白樣本進行預處理，直至膠原蛋白粉末被完全消化；(2)提取膠原蛋...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張俊杰，王永久，潘霞，段蕊，
申請(專利權)人：淮海工學院，江蘇悠然生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32