用于在細胞中標記蛋白質(zhì)或其它生物分子的基于金屬螯合的熒光探針制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供用于使活細胞中的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或其它生物分子成像以監(jiān)控生物事件的基于金屬螯合的熒光探針。所述探針可以標記帶多組氨酸標簽的蛋白質(zhì)或生物分子，同時還能夠共價結(jié)合到標記的蛋白質(zhì)以進一步分析蛋白質(zhì)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】專利技術(shù)背景鑒別和分子水平理解整個生命過程期間的相互作用化學(xué)反應(yīng)在基本生物研究和醫(yī)藥科學(xué)中具有很大價值。熒光成像已長期用于這個目的，原因是其允許我們實時且以高空間分辨率探查活細胞和生物體包括人類中的事件。使用小熒光探針的位點特異性化學(xué)標記是研究細胞和組織中的生物事件的有力和吸引人的技術(shù)，且因此用于探查疾病的機理。具體而言，基于金屬螯合的熒光標記具有高選擇性、小尺寸和共價標記的優(yōu)點。在現(xiàn)代生物化學(xué)中，將多組氨酸標簽基因編碼到POI為蛋白質(zhì)化學(xué)中穩(wěn)健的技術(shù)。His標簽基本上是指具有寡組氨酸的短肽基序，且六個組氨酸的序列為最常見的His標簽。His標簽的組氨酸的咪唑環(huán)可以與各種過渡金屬例如Ni2+、Cu2+、Zn2+等相互作用。因此，通常發(fā)現(xiàn)His標簽與過渡金屬復(fù)合物例如Ni2+-次氮基三乙酸(NTA)復(fù)合物相互作用，由此有助于使用固定化金屬親和層析法(IMAC)純化過表達的蛋白質(zhì)。該相互作用組合亦已廣泛應(yīng)用于位點特異性蛋白質(zhì)標記，這說明了對所報道的廣泛的現(xiàn)有帶寡組氨酸-標簽的蛋白質(zhì)庫的相容性，且His標簽的基因編碼是靈活的，其中其可經(jīng)基因工程改造到用于標記的蛋白質(zhì)靶標的末端或內(nèi)部位點(Soh,N.Sensors8,1004-1024(2008)；Kapanidis,A.N.,Ebright,Y.W.&Ebright,R.H.J.Am.Chem.Soc.123,12123-12125(2001))。最成熟和廣泛使用的基于金屬(或基于類金屬)的小分子熒光探針為F1AsH或其類似物，例如ReAsH和SplAsH(Griffin,B.A.,Adams,S.R.&Tsien，R.Y.Science281，269-272(1998)；Hoffmann，C.等.Nat.Protocols5，1666-1677(2010))。Vogel在2004公開了用于帶多組氨酸標簽的蛋白質(zhì)的另外兩種典型的小熒光傳感物，其具有選擇性、快速和可逆的金屬螯合NTA探針，而Auer在2008合成了不可逆的金屬螯合NTA探針(Guignet，E.G.，Hovius，R.&Vogel，H.Nat.Biotechno1.22，440-444(2004)；Hintersteiner，M.等.ChemBioChem9,1391-1395(2008))。大多數(shù)其它組氨酸標記探針以相同方式發(fā)現(xiàn)，但僅報道標記細胞表面上的蛋白質(zhì)。業(yè)已進行廣泛研究，以僅在穿透肽的存在下且歷時30分鐘以上的孵育時間使用小分子熒光探針使活細胞內(nèi)的帶CysHis6-標簽(CH6-標簽)的蛋白質(zhì)成像(Uchinomiya，S.，Nonaka，H.，Wakayama，S.，Ojida，A.&Hamachi，I.Chem.Commun.49，5022-5024(2013))，遺憾的是，沒有這樣的探針可以直接進入細胞且標記細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。如上所述，用于蛋白質(zhì)標記的基于小分子的熒光探針已長期用于生物醫(yī)藥和臨床科學(xué)，然而這些探針的差的膜滲透性阻止其應(yīng)用。幾種特別基于螯合的這樣的探針業(yè)已上市(例如Invitrogen?的FlAsH、ReAsH和Sp1AsH)。所有這些為雙砷熒光探針，其可以跨過細胞膜以遺傳標記四半胱氨酸融合的目的蛋白質(zhì)。然而小的有機化合物，1，2-乙二硫醇(EDT)必須與探針協(xié)同使用以提高標記率且降低背景。已知砷對人類有毒，而且還是環(huán)境污染物。所述的雙砷探針的合成包括大量采用高毒性的汞和砷，導(dǎo)致嚴重的環(huán)境問題。而且，在氧化環(huán)境中，特異性標記是困難的，由于還原形式的四半胱氨酸基序可易于轉(zhuǎn)化成氧化形式。相比之下，組氨酸選擇大量聚集在特別且重要的蛋白質(zhì)中，且多組氨酸標簽用于蛋白質(zhì)純化。在細胞生物學(xué)和生物醫(yī)藥研究中，四半胱氨酸基序并不像多組氨酸標簽一樣普遍而經(jīng)基因融合到蛋白質(zhì)(Rowinska-Zyrek，M.，Witkowska，D.，Potocki，S.，Remelli，M.&Kozlowski，H.NewJ.Chem.37,58-70(2013))。概述當前，不存在金屬可調(diào)節(jié)探針，其對于標記蛋白質(zhì)的顯現(xiàn)和后續(xù)鑒別實現(xiàn)高通量。文中所述為基于金屬螯合的熒光探針，其用于使活細胞和組織中的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或其它生物分子成像由此監(jiān)控其生物事件并研究疾病機理。通過綴合各種熒光團到金屬-螯合劑和光反應(yīng)性交聯(lián)劑提供具有藍光、紅光和綠光的至少三種不同發(fā)射的一系列探針。通過與不同金屬離子配位，金屬-螯合探針充當潛在的探針以標記帶多組氨酸標簽的蛋白質(zhì)/生物分子。而且，探針還能夠共價結(jié)合到標記的蛋白質(zhì)，使得能夠進一步鑒別蛋白質(zhì)。與使用有毒砷且需要引入四半胱氨酸的最廣泛使用的當前的探針(F1AsH)相比，我們的探針使用通過含氮配體螯合的無毒金屬例如鎳(Il)以使帶多組氨酸-標簽的蛋白質(zhì)成像，其更快速跨過細胞膜且毒性較小。更重要地，考慮到多組氨酸標簽在生物化學(xué)和生物醫(yī)藥研究中的廣泛用途，鑒于大的現(xiàn)有帶多組氨酸標簽的蛋白質(zhì)庫，可更方便地使用所述探針。本專利技術(shù)涉及檢測和顯現(xiàn)細胞中的生物分子。其適用于容易且快速追蹤或追隨生物化學(xué)事件，包括細胞中的蛋白質(zhì)。該制備是簡單的且因此低成本，且該探針可以避免使用砷和四半胱氨酸(其可以影響細胞中的氧化還原環(huán)境)。取而代之地，其它無毒金屬離子例如鎳(Il)摻入到當前的探針中，所述探針靶向經(jīng)基因編碼到蛋白質(zhì)或其它生物分子的多組氨酸標簽。這種探針因此具有替換或至少補充當前使用最多的種類的探針例如F1AsH(ReAsH)的潛在性。本說明書涉及開發(fā)新的基于金屬螯合的熒光探針，其用于使活細胞中的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或其它生物分子成像以監(jiān)控其生物事件。文中進一步描述了探針的設(shè)計和合成。在一方面，提供了用于靶向生物樣品特別是活的樣品中的生物分子的熒光探針。所述熒光探針包含產(chǎn)生熒光信號的熒光團報道部分、螯合用于與編碼到靶蛋白質(zhì)的多組氨酸標簽配位的金屬離子的金屬-螯合部分、連接所述熒光團報道部分和金屬-螯合部分的接頭和充當?shù)桨械鞍踪|(zhì)上的錨點以激增標記親和力和穩(wěn)定性的光反應(yīng)性交聯(lián)劑。在一些實施方案中，在吸收光能之后所述報道部分的熒光信號具有約400-約800nm的波長。所述報道部分包含香豆素-衍生物、熒光素-衍生物和若丹明-衍生物。在一些實施方案中，所述金屬-螯合部分包含多齒配體。所述多齒配體包含次氮基三乙酸(NTA)和亞氮基二乙酸(IDA)。所述金屬-螯合部分還包含含有鎳(II)、鈷(II)和銅(II)金屬離子的螯合金屬離子。在一些實施方案中，所述熒光團和所述金屬-螯合部分之間的接頭設(shè)計為烴鏈或肽序列。在一些實施方案中，所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑包含芳基疊氮化物、雙吖丙啶或二苯甲酮。所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑包含或者不包含作為熒光團的共軛體系的一部分。所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑可以呈現(xiàn)光激活，所述光激活通過在熒光探針與生物樣品中的帶多組氨酸標簽的蛋白質(zhì)配位之后紫外輻射約5-約15分鐘實現(xiàn)。通常所述紫外輻射的范圍為約340nm-約380nm。在一些實施方案中，包括鎳(II)、鈷(II)和銅(II)離子的金屬離子的螯合產(chǎn)生金屬-螯合探針的熒光猝滅。在一些實施方案中，所述探針以1:1摩爾比與金屬離子配位。在一些實施方案中，標記靶生物分子通過經(jīng)由探針的金屬-螯合與編碼到生物分子的多組氨酸標簽本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
用于靶向生物樣品中的生物分子的熒光探針，其包含產(chǎn)生熒光信號的熒光團報道部分、螯合用于與編碼到靶蛋白質(zhì)的多組氨酸標簽配位的金屬離子的金屬?螯合部分、連接所述熒光團報道部分和金屬?螯合部分的接頭，和充當?shù)桨械鞍踪|(zhì)上的錨點的光反應(yīng)性交聯(lián)劑。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2013.12.27 US 61/9211061.用于靶向生物樣品中的生物分子的熒光探針，其包含產(chǎn)生熒光信號的熒光團報道部分、螯合用于與編碼到靶蛋白質(zhì)的多組氨酸標簽配位的金屬離子的金屬-螯合部分、連接所述熒光團報道部分和金屬-螯合部分的接頭，和充當?shù)桨械鞍踪|(zhì)上的錨點的光反應(yīng)性交聯(lián)劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1的熒光探針，其中在吸收光能之后所述報道部分的熒光信號具有約400-約800nm的波長。3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項的熒光探針，其中所述報道部分包含香豆素-衍生物、熒光素-衍生物或若丹明-衍生物。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的熒光探針，其中所述金屬-螯合部分包含多齒配體。5.根據(jù)權(quán)利要求4的熒光探針，其中所述多齒配體包含次氮基三乙酸(NTA)或亞氮基二乙酸(IDA)。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的熒光探針，其中所述金屬-螯合部分包含選自鎳(II)、鈷(II)和銅(II)金屬離子的螯合金屬離子。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的熒光探針，其中所述熒光團報道部分和所述金屬-螯合部分之間的接頭為烴鏈或肽序列。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的熒光探針，其中所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑包含芳基疊氮化物、雙吖丙啶或二苯甲酮。9.根據(jù)權(quán)利要求8的熒光探針，其中在所述熒光探針與生物樣品中帶多組氨酸標簽的蛋白質(zhì)配位之后，當經(jīng)受紫外輻射約5-約15分鐘時，所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑呈現(xiàn)光激活。10.根據(jù)權(quán)利要求9的熒光探針，其中所述紫外輻射的范圍為約340nm-約380nm。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的熒光探針，其中選自鎳(II)、鈷(II)和銅(II)離子的金屬離子的螯合產(chǎn)生金屬-螯合探針的熒光猝滅。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的熒光探針，其中所述探針以1:1摩爾比與金屬離子配位。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的熒光探針，其中標記靶生物分子通過經(jīng)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫紅哲，黎佑芷，陽婭，
申請(專利權(quán))人：香港大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：中國香港;81