一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針FO-PSe及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)設(shè)計(jì)合成了一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針FO-PSe及其制備方法和應(yīng)用。以易得的已合成的兩種化合物為起始原料，經(jīng)過(guò)一步簡(jiǎn)易、高效的合成反應(yīng)制得該探針，且后處理容易、純化簡(jiǎn)便。該熒光探針具有雙光子性質(zhì)，能有效地降低背景熒光干擾，而且對(duì)次氯酸具有可逆性，能動(dòng)態(tài)可逆的檢測(cè)次氯酸的濃度。將其用于活細(xì)胞及活體成像得到了良好效果，而且實(shí)現(xiàn)了老鼠腹腔部位不同深度次氯酸的成像分析。本發(fā)明專利技術(shù)探針結(jié)構(gòu)新穎、光物理性質(zhì)優(yōu)良。為研究活細(xì)胞及活體內(nèi)次氯酸的功能及生物學(xué)意義提供了一種良好的熒光工具。

Two photon reversible fluorescent probe FO-PSe for detection of hypochlorite and preparation method and application thereof

The present invention is designed and synthesized a two-photon reversible fluorescent probe FO-PSe, and its preparation method and application. The synthesized two kinds of compounds were used as starting materials. The probe was prepared by a simple and efficient synthetic reaction. The fluorescent probe has two photon properties, which can effectively reduce the background fluorescence interference, and can be used to dynamically detect the concentration of hypochlorite. It has been used in living cells and in vivo imaging, and has achieved good results. The invention has the advantages of novel structure and excellent optical and physical properties. The present study provides a good fluorescence tool for the study of the function and biological significance of hypochlorite in living cells and living organisms.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

：本專利技術(shù)屬于合成領(lǐng)域，特別涉及一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針FO-PSe及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
：次氯酸在人體內(nèi)是重要的活性氧之一，它在生物體的生理和病理等方面都起著至關(guān)重要的作用。在生物體中過(guò)氧化氫和氯離子在髓過(guò)氧化物酶的催化作用下能夠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)物次氯酸根及其質(zhì)子化的形式即次氯酸在生理?xiàng)l件下存在于生物體內(nèi)。次氯酸是一種具有強(qiáng)親核能力的的氧化性物質(zhì)，它可以與生物體內(nèi)的多種分子如RNA,DNA,脂肪酸，膽固醇及多種蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。次氯酸最顯著的作用是其強(qiáng)抗菌性，它是通過(guò)把某種病毒接觸反應(yīng)中所需的酶氧化掉，從而達(dá)到殺菌抗菌的目的。如果次氯酸的濃度出現(xiàn)異常，就會(huì)對(duì)生命體系造成極大的破壞，同時(shí)引發(fā)一些嚴(yán)重的疾病，如關(guān)節(jié)炎，動(dòng)脈硬化及一些癌癥等，因此發(fā)展用于次氯酸檢測(cè)的工具是很有意義的。近幾年來(lái)，已報(bào)道了HClO的熒光探針數(shù)種，如DCFH、DHR(參見(jiàn)文獻(xiàn)：A.Bizyukin，etal，Bull.Exp.Biol.Med.1995，119，347.)、APF(文獻(xiàn)：T.Nagano，J.Biol.Chem.2003，278，3170.)、MitoAR(文獻(xiàn)：T.Nagano.J.Am.Chem.Soc.2007，129，10324.)等，但以上探針除了能夠檢測(cè)HClO，對(duì)其他的活性氧物種亦有不同程度的熒光響應(yīng)。由于每種活性氧都有其各自獨(dú)特的生理或病理作用，因此對(duì)專一性強(qiáng)的HClO熒光探針的需求顯得尤為迫切。已報(bào)道的另外一些HClO探針中，有的需在pH12的苛刻的操作條件(文獻(xiàn)：H.M.Ma，Chem.Eur.J.2008，14，4719.)，或水溶性差(文獻(xiàn)：W.Tan，etal，Chem.Eur.J.2009，15，2305.)，無(wú)法真正應(yīng)用于生物體系中。目前，能夠真正應(yīng)用于細(xì)胞中HClO檢測(cè)的熒光探針極少，需在繁瑣苛刻的條件下多步驟高成本制備而得(文獻(xiàn)：T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.2007，129，7313.；文獻(xiàn)：J.Tae，Org.Lett.2009，11，(4)，859.；文獻(xiàn)：R.Weissleder，P.Libby，Chem.Biol.2007，14，1221.)。熒光法具有高靈敏度、高選擇性、簡(jiǎn)單方便、實(shí)時(shí)原位檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，使其在生命和環(huán)境科學(xué)、分析化學(xué)等領(lǐng)域有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。因此設(shè)計(jì)高靈敏度、高選擇性、快速識(shí)別的新型次氯酸熒光探針得到人們?cè)絹?lái)多的重視，同時(shí)也成為一項(xiàng)非常重要的課題。雙光子熒光探針被廣泛用于生物成像領(lǐng)域，由于其對(duì)生物組織樣品較低的光損傷、較深的組織穿透能力、較低的生物背景熒光干擾等優(yōu)點(diǎn)。因此，新型的雙光子熒光探針的合成和發(fā)展是非常必要的，尤其可逆型的雙光子的設(shè)計(jì)、合成還是非常具有挑戰(zhàn)性的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于彌補(bǔ)目前次氯酸檢測(cè)中，雙光子可逆型熒光探針較少的狀況，簡(jiǎn)易、高效地合成了一種雙光子可逆型熒光探針(FO-PSe),可逆是指熒光探針(FO-PSe)可與次氯酸發(fā)生氧化反應(yīng)，熒光增強(qiáng)；之后又可與GSH發(fā)生還原反應(yīng)，熒光減弱，如此循環(huán)多次。將其成功應(yīng)用于活細(xì)胞及活體中次氯酸的成像分析，而且可以實(shí)現(xiàn)活體中腹腔部位不同深度次氯酸的成像分析，基本無(wú)背景熒光，效果良好。一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針FO-PSe，其結(jié)構(gòu)式為：上述的探針FO-PSe的制備方法，包括如下步驟：取原料1和2溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入適量的二硫蘇糖醇和1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯，于75-100℃反應(yīng)25-40h，萃取、干燥、二次溶解、過(guò)柱分離，即得；所述原料1的結(jié)構(gòu)式為：所述原料2為二苯基二硒。優(yōu)選的，上述原料1和2、二硫蘇糖醇、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N-二甲基甲酰胺物質(zhì)的量之比為1-2:3-6:5-10:10-15。優(yōu)選的，上述過(guò)柱分離所用洗脫劑體積比為石油醚：二氯甲烷5-9:1-2(V/V)。上述的探針FO-PSe可用于檢測(cè)生物體內(nèi)或外的次氯酸含量。上述的探針FO-PSe可用于定量檢測(cè)次氯酸。上述的探針FO-PSe可用于活細(xì)胞和斑馬魚(yú)及小鼠的活體成像。上述的探針FO-PSe可用于激光共聚焦成像。本專利技術(shù)還提供了一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子激光檢測(cè)系統(tǒng)，包括雙光子激光共聚焦顯微鏡和上述的探針FO-PSe。本專利技術(shù)還發(fā)現(xiàn)：探針FO-PSe檢測(cè)生物體內(nèi)或外的次氯酸時(shí)，優(yōu)選的激發(fā)光的波長(zhǎng)為425-450nm或800～825nm。本專利技術(shù)設(shè)計(jì)合成了一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針，命名為FO-PSe，它具有雙光子性質(zhì)，并且是可逆型的熒光探針。我們成功地將其應(yīng)用于活細(xì)胞及活體內(nèi)次氯酸的研究，取得了良好的效果。其簡(jiǎn)易、高效的合成步驟及優(yōu)良的光物理性質(zhì)屬于合成與
通常，可以將染料分子溶解在緩沖液或由DMSO等水溶性有機(jī)溶劑中，然后加入適當(dāng)緩沖液及其他有機(jī)試劑進(jìn)行測(cè)試。我們分別研究了探針FO-PSe在pH＝7.4緩沖水溶液及各種常見(jiàn)的有機(jī)試劑中的光物理性質(zhì)并將其用于活細(xì)胞和斑馬魚(yú)及小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)?；罴?xì)胞和斑馬魚(yú)活體的染色方法是將探針加入培養(yǎng)好的活細(xì)胞或斑馬魚(yú)培養(yǎng)液中，孵育一定的時(shí)間去除孵育液，并用PBS緩沖液洗滌3次，然后進(jìn)行激光共聚焦成像)。小鼠活體染色的方法是用注射器將探針?lè)肿幼⑸涞嚼鲜蟾骨徊课?，然后進(jìn)行激光共聚焦成像。本專利技術(shù)利用以前已有的原料中間體1和2，由一步簡(jiǎn)易、高效合成，最后經(jīng)過(guò)薄層色譜柱分離得到探針FO-PSe。本專利技術(shù)的有益效果是：(1)該探針?lè)肿泳哂须p光子性質(zhì),有效地降低了自吸收，提高了成像準(zhǔn)確度。(2)該探針對(duì)次氯酸具有可逆性，可以動(dòng)態(tài)可逆的檢測(cè)生物體系中次氯酸的濃度變化。(3)活細(xì)胞和斑馬魚(yú)及小鼠染色效果良好。染色時(shí)間較短(10min)，染色效率較高。(4)合成步驟相對(duì)簡(jiǎn)單、產(chǎn)率較高、容易純化。附圖說(shuō)明圖1是本專利技術(shù)新型熒光探針的激發(fā)光譜及發(fā)射光譜譜圖，其中a為激發(fā)光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為425nm,b為發(fā)射光譜，發(fā)射波長(zhǎng)為530nm；橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。圖2是本專利技術(shù)新型熒光探針與次氯酸作用前后的雙光子熒光發(fā)射譜圖，其中a為熒光探針與次氯酸作用前的雙光子發(fā)射光譜，b為熒光探針與次氯酸作用后的雙光子發(fā)射光譜；橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)為熒光發(fā)射強(qiáng)度。圖3是本專利技術(shù)新型熒光探針(10μM)與加入不同濃度的次氯酸(0-100μM)，單光子熒光光譜。Inset:探針的熒光強(qiáng)度與次氯酸濃度的線性相關(guān)性。圖4是本專利技術(shù)新型熒光探針細(xì)胞成像圖，即與巨噬細(xì)胞單本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針FO?PSe，其特征在于，結(jié)構(gòu)式為：

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針FO-PSe，其特征在于，結(jié)構(gòu)式為：
2.權(quán)利要求1所述的探針FO-PSe的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
取原料1和2溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入二硫蘇糖醇和1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十
一碳-7-烯，于75-100℃反應(yīng)25-40h，萃取、干燥、二次溶解、過(guò)柱分離，即得；
所述原料1的結(jié)構(gòu)式為：
所述原料2為二苯基二硒。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述原料1和2、二硫蘇糖醇、1,8-二氮雜雙
環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N-二甲基甲酰胺物質(zhì)的量之比為1-2:3-6:5-10:10-15。
4.如權(quán)利要求2所述的方法...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張衛(wèi)，劉偉，李平，唐波，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：山東師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東;37