基于催化信號放大的ApoE試劑盒制造技術

本發明專利技術提供了一種基于催化信號放大的ApoE試劑盒，所述試劑盒包含R1試劑、R2試劑及校準品；所述R1試劑為含有辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖體系，所述R2試劑為含有?ApoE抗體和生物素標記的生物胺的磷酸緩沖體系，所述校準品包括4支不同ApoE濃度的牛血清基質校準品。本發明專利技術采用低分子含氮生物胺催化信號放大技術，利用敏感度極強的生物胺與過氧化物酶反應，增加試劑的反應濁度，使試劑的靈敏度提高，減少抗體用量，大大降低試劑成本，本發明專利技術解決了目前市場上ApoE試劑檢測靈敏度不高，價格昂貴等問題，明顯提高了測定結果的靈敏度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬醫學免疫體外診斷領域，具體涉及一種基于催化信號放大的ApoE試劑盒。
技術介紹
載脂蛋白E(ApoE)是一個含有299個氨基酸結合有磷脂的糖蛋白。其分子量為34kD。ApoE可以在各種組織中合成，但肝臟為主，首先合成的是含有317個氨基酸的前肽，這個前肽在內質網中經過蛋白水解作用除去18個氨基酸的信號肽，再經過糖基化作用和細胞外液的脫唾液酸形成成熟的ApoE；ApoE分泌入血液后轉移到脂蛋白中。ApoE是脂蛋白所必須的結構蛋白，可通過與各組織細胞的受體結合，參與脂蛋白代謝，調節膽固醇水平，激活卵磷脂膽固醇脂酰轉移酶(LCAT)，并具有某種免疫調節作用。測定ApoE對診斷和治療高脂血癥動脈粥樣硬化等疾病提供了重要理論依據。ApoE的檢測原理為：試劑中的ApoE抗體與檢測標本血清中的ApoE相遇，形成不溶性的抗原-抗體復合物，使反應液產生渾濁。通過測定340nm波長吸光度，并與校準曲線比較，求出標本中ApoE的含量。已知測定ApoE的方法有層析法、電泳法、免疫分析法、其中層析法和電泳法操作繁瑣，不能進行批量樣本分析和直接上全自動生化分析儀等缺點，而免疫分析法中的免疫擴散法、放射免疫分析法、熒光標記免疫分析法、酶標記免疫分析法、化學發光免疫分析法也存在諸多不足之處；如需特殊的設備，樣品需處理，不能上全自動生化分析儀進行批量監測分析等。臨床常用的免疫比濁法因其樣本用量少，可直接在全自動生化分析儀上批量樣本分析、操作簡單受其歡迎。目前國內檢測ApoE普遍采用免疫比濁法，該方法雖然操作簡便，但靈敏度不高，不能滿足臨床對ApoE定量的要求。原因是國內ApoE檢測試劑所用抗體存在純度不高、批間差大等問題，而且主要抗原來源主要依靠進口，價格昂貴。
技術實現思路
針對現有技術中的缺陷，本專利技術的目的是提供一種基于催化信號放大的ApoE試劑盒。該試劑盒用于檢測血清中的ApoE的含量，以達到操作簡便、靈敏度高、特異性好，快速、測定結果準確可靠的目的。本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的：本專利技術提供了一種基于催化信號放大的ApoE試劑盒，包含R1試劑、R2試劑及校準品；所述R1試劑為含有辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖體系，所述R2試劑為含有-ApoE抗體和生物胺的磷酸緩沖體系，所述校準品包括4支不同ApoE濃度的牛血清基質校準品。優選地，所述R1試劑包括以下濃度的各組分：PH7.0～7.6、50～200mmol/L磷酸鹽緩沖液，50～200mmol/L聚合物，10～20mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，以及體積分數為0.1％～2％(V/V)辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。鏈霉親和素能與R2中的生物素發生不可逆反應而緊密結合在一起，產生生物素沉積。優選地，所述聚合物為聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖中的一種或幾種。優選地，所述R2試劑包括以下濃度的各組分：PH7.0～7.6、50～200mmol/L磷酸鹽緩沖液，10～20mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，體積分數為0.1‰～2‰(V/V)的吐溫-20，體積分數為10％～50％(V/V)ApoE抗體，10～200mmol/L生物素標記的含氮低分子生物胺。所述含氮低分子生物胺的濃度低于10mmol/L，會導致試劑靈敏度下降；濃度高于200mmol/L,會導致試劑的檢測精密度下降。優選地，所述含氮低分子生物胺包括酪胺、鹽酸-3-羥基酪胺、苯乙胺中的一種或幾種。優選地，所述4支牛血清基質校準品的ApoE濃度分別為1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl。由于抗原抗體結合的過程中，吸光度與濃度之間不成線性關系，一般是三次方程曲線關系，采用多點定標方式，經三次曲線方程擬合出一條能反應真實情況的濃度與吸光度的關系曲線方程，使得檢測結果更準確。優選地，所述牛血清基質校準品中還包括以下濃度的各組分：防腐劑0.2～2.2％、吐溫-201～10％、保護劑1～3％。優選地，所述防腐劑包括Proclin300。優選地，所述保護劑包括甘油、蔗糖、甘露醇、山梨醇中的一種或幾種。優選地，所述牛血清基質校準品的制備方法包括以下步驟：在經過處理的牛血清，加入保護劑1～3％吐溫-201～10％、防腐劑0.2～2.2％得到校準品稀釋液；將ApoE溶于校準品稀釋液中，即制備得不同ApoE濃度的牛血清基質校準品。本專利技術基于催化信號放大技術，采用免疫比濁法檢測血清中的ApoE含量。采用低分子含氮生物胺催化信號放大，由于其敏感度極強，使得本專利技術的方法靈敏度能夠檢測到0.05mg/dl提高，而且可以減少抗體的使用量，降低了試劑的成本。與現有技術相比，本專利技術具有如下的有益效果：(1)本專利技術試劑盒校準品采用牛血清基質，該牛血清基質由無HBV、HIV、HAV、HCV、TP傳染源，對操作者危害極小；(2)在試劑R1、R2中分別加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉親和素、生物素標記的含氮低分子生物胺，利用生物胺的過氧化物酶反應，生物胺在HRP催化下形成共價結合位點，產生大量酶促產物，這些產物可以與周圍的蛋白殘基結合，使得抗原-抗體結合部位有大量的生物素沉積，引起明顯的濁度變化，使試劑靈敏度大大提高，在樣品濃度低至0.05mg/dl時仍可檢測出結果，而市售試劑的最低檢測限為0.2mg/dl；(3)本專利技術試劑盒與市售試劑(強盛生物試劑)相比靈敏度明顯提高，如本專利技術試劑盒測定生理鹽水時吸光度變化為1.4(1/10000A)，理論濃度為5mg/dl血清樣本時吸光度變化為1064.8(1/10000A)，而強盛生物試劑測定生理鹽水時吸光度變化為17.6(1/10000A)，理論濃度為5mg/dl血清樣本時吸光度變化為617.4(1/10000A)。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本專利技術的其它特征、目的和優點將會變得更明顯：圖1為4種不同含量的ApoE參考標準的標準曲線；圖2為分別采用本專利技術試劑和英國朗道公司的ApoE試劑對50份人血清測定結果的相關性分析圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本專利技術，但不以任何形式限制本專利技術。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本專利技術構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本專利技術的保護范圍。下面結合具體實施例對本專利技術進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本專利技術，但不以任何形式限制本專利技術。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本專利技術構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本專利技術的保護范圍。實施例1本實施例提供一種基于信號放大的ApoE檢測試劑盒，組成如下：1.試劑R1為：2.試劑R2為：3.校準品4支ApoE濃度分別為1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl的牛血清基質校準品；每支牛血清基質校準品中還包括甘油1％，Proclin3000.5％，吐溫-201％。所述牛血清基質校準品制備：將經過處理的牛血清，加入甘油1％，Proclin3000.5％，吐溫-201％得到校準品稀釋液。用ApoE溶于制備的類似人血清基質的溶液，制備本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于催化信號放大的ApoE試劑盒，其特征在于，包含R1試劑、R2試劑及校準品；所述R1試劑為含有辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖體系，所述R2試劑為含有?ApoE抗體和生物素標記的生物胺的磷酸緩沖體系，所述校準品包括4支不同ApoE濃度的牛血清基質校準品。

【技術特征摘要】
1.一種基于催化信號放大的ApoE試劑盒，其特征在于，包含R1試劑、R2試劑及校準品；所述R1試劑為含有辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖體系，所述R2試劑為含有-ApoE抗體和生物素標記的生物胺的磷酸緩沖體系，所述校準品包括4支不同ApoE濃度的牛血清基質校準品。2.根據權利要求1所述的基于催化信號放大的ApoE試劑盒，其特征在于，所述R1試劑包括以下濃度的各組分：PH7.0～7.6、50～200mmol/L磷酸鹽緩沖液，50～200mmol/L聚合物，10～20mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，以及體積分數為0.1％～2％的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。3.根據權利要求2所述的基于催化信號放大的ApoE試劑盒，其特征在于，所述聚合物為聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖中的一種或幾種。4.根據權利要求1所述的基于催化信號放大的ApoE試劑盒，其特征在于，所述R2試劑包括以下濃度的各組分：PH7.0～7.6、50～200mmol/L磷酸鹽緩沖液，10～20mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，體積分數為0.1‰～2‰的吐溫-20，體積分數為10％～50％的ApoE抗體，10～200mmol/L生物素標記的含...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李偉奇，陳瑛，房君江，張秀文，林清玉，
申請(專利權)人：上海睿康生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31