超靈敏檢測癌細胞的電致化學發光細胞傳感器的制備方法技術

本發明專利技術公開了一種超靈敏檢測癌細胞的電致化學發光細胞傳感器的制備方法。通過原位生長法制備具有大的比表面積、良好的生物相容性和導電性的三維花狀的紙金電極，利用其捕獲目標癌細胞，通過癌細胞與特定適配體的特異性結合作用，將修飾有銀納米粒子的多枝雜交鏈負載在電極表面，然后在多枝雜交鏈上修飾和沉積大量的石墨烯量子點和銀納米粒子，完成電致化學發光細胞傳感器的制備，利用多枝雜交鏈信號放大技術和銀納米粒子可以增強石墨烯量子點電致化學發光的性能實現信號放大，進而實現對癌細胞的超靈敏、準確檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及癌細胞分析檢測技術、多枝雜交鏈信號放大技術、紙芯片技術及復合納米材料
，更具體地說是一種用于超靈敏檢測癌細胞的電致化學發光細胞傳感器的制備。
技術介紹
靈敏地檢測癌細胞在癌癥的早期檢測、轉移及治療中具有重要的意義。到目前為止，一些檢測方法像流式細胞術、聚合酶鏈反應、微量測定分析法和細胞濃縮方法已經被發展并用于癌細胞的檢測。由于在血清中循環流通的腫瘤細胞的數量是非常少的，因此仍急需發展一種超靈敏、準確的檢測癌細胞的分析方法。石墨烯量子點（GQDs）作為一種以碳為基礎的發光材料，由于其無毒性、良好的生物相容性、水溶性及獨特的光和電性能在電致化學發光（ECL）傳感器中被廣泛地應用。提高ECL傳感器靈敏度的關鍵是提高GQDs的ECL響應。銀納米粒子（AgNPs）具有良好的導電性和生物相容性，其可以減小ECL發射源和工作電極之間的電子傳播阻礙。基于AgNPs獨特的性能，我們利用AgNPs增強GQDs的ECL發射，獲得更強的ECL響應。目前，以DNA為基礎的信號放大技術在生物分析中被廣泛地利用。其中，多枝雜交鏈信號放大技術引起了廣泛的研究興趣，通過多枝雜交鏈反應，可以獲得更長的帶有多條分枝的DNA雙螺旋，這種獨特的DNA雙螺旋結構有利于負載更多的GQDs和AgNPs，極大地放大ECL響應。為了進一步放大分析檢測信號，我們利用AgNPs對Ag+良好的催化還原作用，在DNA雙螺旋骨架上沉積更多的AgNPs，更高地增強GQDs的ECL響應，提高分析檢測的靈敏度。
技術實現思路
本專利技術的目的是通過原位生長法制備具有大的比表面積、良好的生物相容性和導電性的三維花狀的紙金電極，利用其捕獲目標癌細胞，通過癌細胞與特定適配體的特異性結合作用，將修飾有AgNPs的多枝雜交鏈負載在電極表面，然后在多枝雜交鏈上修飾和沉積大量的GQDs和AgNPs，完成ECL細胞傳感器的制備，實現對癌細胞的超靈敏、準確檢測。為了解決上述技術問題，本專利技術是通過以下措施來實現的：（1）在計算機上利用AdobeillustratorCS4軟件設計微流控紙芯片的疏水蠟打印圖案，將設計好的打印圖案通過蠟打印機打印在色譜紙上，然后將打印過的色譜紙放在烘箱中，在130℃加熱50秒使蠟融化并滲透整個色譜紙的厚度，形成疏水墻；（2）在計算機上設計與步驟（1）中獲得的蠟打印圖案相匹配的工作電極、對電極和參比電極的印刷圖案，并利用絲網印刷技術在步驟（1）中獲得的蠟打印色譜紙上印刷碳工作電極、碳對電極和Ag/AgCl參比電極；（3）利用原位生長法在步驟（2）中獲得的碳工作電極的工作區域生長三維花狀的金；（4）將伴刀豆球蛋白A修飾在步驟（3）中獲得的紙芯片的工作區域，采用牛血清白蛋白封閉非特異性結合位點，然后利用伴刀豆球蛋白A捕獲癌細胞；（5）將AgNPs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區域；（6）將GQDs修飾在步驟（5）中獲得的多枝雜交鏈上；（7）在步驟（6）中獲得的多枝雜交鏈上沉積AgNPs；（8）在步驟（7）中獲得的紙芯片的工作區域，滴加10μL包含0.1MK2S2O8的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），在電壓范圍為0~-1.6V進行ECL信號檢測，光電倍增管電壓為800V，繪制ECL強度與癌細胞濃度的標準曲線，實現對癌細胞的檢測。本專利技術所述的利用原位生長法在步驟（2）中獲得的碳工作電極的工作區域生長三維花狀的金的具體步驟為：（1）合成金納米粒子：首先將90mL二次水置于單口燒瓶中并加熱到90℃，然后加入0.8mL1%氯金酸，繼續水浴加熱到96℃，待反應進行1min后，再加入2.8mL1%檸檬酸鈉，在磁力攪拌下反應15min，獲得酒紅色的溶液；（2）取10-20μL金納米粒子滴加到工作區域，在室溫下靜置反應30-60min，用二次水洗滌除去多余的金納米粒子，取10-20μL新鮮制備的氯金酸和抗壞血酸的混合溶液滴加到工作區域，所述的氯金酸的濃度為10-15mM，抗壞血酸的濃度為80-120mM，在室溫下生長20-40min后，用二次水清洗工作區域并在室溫下自然干燥30min。本專利技術所述的將伴刀豆球蛋白A修飾在步驟（3）中獲得的紙芯片的工作區域，采用牛血清白蛋白封閉非特異性結合位點，然后利用伴刀豆球蛋白A捕獲癌細胞的具體步驟為：取10μL伴刀豆球蛋白A滴到紙工作區域，在室溫下孵化30min，用pH7.4PBS洗滌除去多余的伴刀豆球蛋白A后，滴加10μL1%的牛血清白蛋白用于封堵非特異性結合位點，利用pH7.4PBS洗滌后，繼續滴加10μL不同濃度的癌細胞，在37℃下孵化40min，隨后用pH7.4PBS洗滌除去未反應的癌細胞。本專利技術所述的將AgNPs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區域的具體步驟為：（1）合成AgNPs：首先制備20mL硝酸銀和檸檬酸鈉的混合溶液，所述的硝酸銀和檸檬酸鈉的濃度均為0.1-0.5mM且摩爾比為1:1，在磁力攪拌作用下，向混合液中加入0.5-1mL新鮮制備的濃度為10-20mM硼氫化鈉，繼續攪拌20-50秒，獲得AgNPs溶液；（2）在發夾DNA分子1（H1）和發夾DNA分子2（H2）上連接AgNPs：將H1和H2溶解于pH5.0的三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽中，靜置處理1h，隨后將活化的H1和H2用C18分離填充柱脫鹽，并進行冷凍干燥，然后將冷凍干燥后的H1和H2溶解在1mL濃度為0.5M，pH7.6的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）中，獲得的H1和H2濃度均為10μM且摩爾比為1:1，繼續加入500μLAgNPs，緩慢地震蕩5min后，加入15μL濃度為0.5M，pH3.0的檸檬酸鹽緩沖溶液，在室溫下孵化5min，隨后繼續加入15μL濃度為0.5M，pH3.0的檸檬酸鹽緩沖溶液，在室溫下孵化25min后，用pH7.6HEPES將混合液調節至中性，并用pH7.6HEPES離心洗滌5次，獲得H1-Ag和H1-Ag；（3）多枝雜交鏈反應：將上述獲得H1-Ag和H1-Ag溶解在1mL雜交鏈反應緩沖溶液（TM）中，所述的TM為pH8.0，濃度為20mM且含有50mMMgCl2的Tris緩沖溶液，然后用PTC-200熱循環儀在95oC加熱10min，并在30s內冷卻到4oC，隨后加入100μL捕獲癌細胞的適配體鏈和引物鏈的混合液，所述的捕獲癌細胞的適配體鏈和引物鏈的濃度均為5μM且摩爾比為1:1，最后將獲得的混合液在37oC反應12h，獲得AgNPs修飾的多枝雜交鏈；（4）取10μL上述獲得的AgNPs修飾的多枝雜交鏈滴加到步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區域，在37oC孵化30min后，用pH7.4PBS洗滌除去未反應的多枝雜交鏈。本專利技術所述的將GQDs修飾在步驟（5）中獲得的多枝雜交鏈上的具體步驟為：（1）合成GQDs:稱取1-2g檸檬酸，置于25mL的小燒杯中，放在烘箱中于200oC加熱20-30min，待冷卻至室溫后，用濃度為1000M的氫氧化鈉溶液調節pH至8.0，獲得黃棕色的GQDs溶液；（2）取10μL上述獲得GQDs溶液滴加到步驟（5）中獲得的紙芯片的工作區域，在室溫下孵化2h后，用pH7.4PBS洗滌除去未反應的GQDs。本專利技術所述的在步驟（6）中獲得的多枝雜交鏈上本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種超靈敏檢測癌細胞的電致化學發光細胞傳感器的制備方法，其特征是包括以下步驟：（1）在計算機上利用Adobe?illustrator?CS4軟件設計微流控紙芯片的疏水蠟打印圖案，將設計好的打印圖案通過蠟打印機打印在色譜紙上，然后將打印過的色譜紙放在烘箱中，在130?℃加熱50秒使蠟融化并滲透整個色譜紙的厚度，形成疏水墻；（2）在計算機上設計與步驟（1）中獲得的蠟打印圖案相匹配的工作電極、對電極和參比電極的印刷圖案，并利用絲網印刷技術在步驟（1）中獲得的蠟打印色譜紙上印刷碳工作電極、碳對電極和Ag/AgCl參比電極；（3）利用原位生長法在步驟（2）中獲得的碳工作電極的工作區域生長三維花狀的金；（4）將伴刀豆球蛋白A修飾在步驟（3）中獲得的紙芯片的工作區域，采用牛血清白蛋白封閉非特異性結合位點，然后利用伴刀豆球蛋白A捕獲癌細胞；（5）將AgNPs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區域；（6）將GQDs修飾在步驟（5）中獲得的多枝雜交鏈上；（7）在步驟（6）中獲得的多枝雜交鏈上沉積AgNPs；（8）在步驟（7）中獲得的紙芯片的工作區域，滴加10?μL包含0.1?M?K2S2O8的pH?7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），在電壓范圍為0?~??1.6V進行ECL信號檢測，光電倍增管電壓為800?V，繪制ECL強度與癌細胞濃度的標準曲線，實現對癌細胞的檢測。...

【技術特征摘要】
1.一種超靈敏檢測癌細胞的電致化學發光細胞傳感器的制備方法，其特征是包括以下步驟：（1）在計算機上利用AdobeillustratorCS4軟件設計微流控紙芯片的疏水蠟打印圖案，將設計好的打印圖案通過蠟打印機打印在色譜紙上，然后將打印過的色譜紙放在烘箱中，在130℃加熱50秒使蠟融化并滲透整個色譜紙的厚度，形成疏水墻；（2）在計算機上設計與步驟（1）中獲得的蠟打印圖案相匹配的工作電極、對電極和參比電極的印刷圖案，并利用絲網印刷技術在步驟（1）中獲得的蠟打印色譜紙上印刷碳工作電極、碳對電極和Ag/AgCl參比電極；（3）利用原位生長法在步驟（2）中獲得的碳工作電極的工作區域生長三維花狀的金；（4）將伴刀豆球蛋白A修飾在步驟（3）中獲得的紙芯片的工作區域，采用牛血清白蛋白封閉非特異性結合位點，然后利用伴刀豆球蛋白A捕獲癌細胞；（5）將AgNPs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區域；（6）將GQDs修飾在步驟（5）中獲得的多枝雜交鏈上；（7）在步驟（6）中獲得的多枝雜交鏈上沉積AgNPs；（8）在步驟（7）中獲得的紙芯片的工作區域，滴加10μL包含0.1MK2S2O8的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），在電壓范圍為0~-1.6V進行ECL信號檢測，光電倍增管電壓為800V，繪制ECL強度與癌細胞濃度的標準曲線，實現對癌細胞的檢測。2.根據權利要求書1所述一種超靈敏檢測癌細胞的電致化學發光細胞傳感器的制備方法，其特征是，所述的利用原位生長法在步驟（2）中獲得的碳工作電極的工作區域生長三維花狀的金的具體步驟為：（1）合成金納米粒子：首先將90mL二次水置于單口燒瓶中并加熱到90℃，然后加入0.8mL1%氯金酸，繼續水浴加熱到96℃，待反應進行1min后，再加入2.8mL1%檸檬酸鈉，在磁力攪拌下反應15min，獲得酒紅色的溶液；（2）取10-20μL金納米粒子滴加到工作區域，在室溫下靜置反應30-60min，用二次水洗滌除去多余的金納米粒子，取10-20μL新鮮制備的氯金酸和抗壞血酸的混合溶液滴加到工作區域，所述的氯金酸的濃度為10-15mM，抗壞血酸的濃度為80-120mM，在室溫下生長20-40min后，用二次水清洗工作區域并在室溫下自然干燥30min。3.根據權利要求書1所述一種超靈敏檢測癌細胞的電致化學發光細胞傳感器的制備方法，其特征是，所述的將伴刀豆球蛋白A修飾在步驟（3）中獲得的紙芯片的工作區域，采用牛血清白蛋白封閉非特異性結合位點，然后利用伴刀豆球蛋白A捕獲癌細胞的具體步驟為：取10μL伴刀豆球蛋白A滴到紙工作區域，在室溫下孵化30min，用pH7.4PBS洗滌除去多余的伴刀豆球蛋白A后，滴加10μL1%的牛血清白蛋白用于封堵非特異性結合位點，利用pH7.4PBS洗滌后，繼續滴加10μL不同濃度的癌細胞，在37℃下孵化40min，隨后用pH7.4PBS洗滌除去未反應的癌細胞。4.根據權利要求書1所述一種超靈敏檢測癌細胞的電致化學發光細胞傳感器的制備方法，其特征是，所述的將AgNP...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊紅梅，張彥，李麗，徐金夢，于京華，葛慎光，顏梅，
申請(專利權)人：濟南大學，
類型：發明
國別省市：山東;37