間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒制造技術

本發(fā)明專利技術涉及乳膠法免疫層析領域，具體公開了一種間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于所述襯底上，所述致敏乳膠聚酯膜上包被有彩色乳膠顆粒標記的抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅰ，免疫硝酸纖維素膜上設有包被了抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅱ的檢測線和包被了羊抗兔IgG的質控線。本發(fā)明專利技術的間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒反應靈敏，檢測方便、檢測結果穩(wěn)定，節(jié)約成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及免疫層析
，具體涉及一種間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒及其制備與應用。
技術介紹
瘧疾是經按蚊叮咬或輸入帶瘧原蟲者的血液而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病。寄生于人體的瘧原蟲共有四種，即間日瘧原蟲，三日瘧原蟲，惡性瘧原蟲和卵形瘧原蟲。在我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲；其他二種少見，近年偶見國外輸入的一些病例。不同的瘧原蟲分別引起間日瘧、三日瘧、惡性瘧及卵圓瘧。瘧疾為世界五大寄生蟲病之一，有很高的發(fā)病率和死亡率，普遍存在于熱帶及亞熱帶地區(qū)，位于赤道周圍的寬大帶狀區(qū)域。主要流行地區(qū)是非洲中部、南亞、東南亞及南美北部的熱帶地區(qū)，這其中又以非洲的疫情最甚。就中國而言，瘧疾主要的流行地帶為華中華南的叢林多山地區(qū)，但疫情遠較非洲為輕。瘧疾是以周期性冷熱發(fā)作為最主要特征，脾腫大、貧血以及腦、肝、腎、心、腸、胃等受損引起的各種綜合征。患者每年在3億～5億之間，因患瘧疾而死亡的人數在1百萬～3百萬之間，其中大部分為兒童。及早、快速有效地檢測瘧原蟲是有效防治瘧疾的關鍵。傳統(tǒng)的檢測方法是通過血涂片顯微鏡檢查來判斷，這種方法簡便、經濟、準確率高，缺點是判斷結果受檢驗人員鏡檢水平和視力疲勞程度等因素的影響，易導致誤診和漏檢且檢查效率不高，不適合大規(guī)模現場調查和短時間大批量處理樣本。乳膠層析法是以彩色乳膠為標記物的免疫層析法，其檢測原理與膠體金免疫層析法相類似，它不需要儀器，直接用肉眼判讀結果，具有操作簡單、快速，試劑穩(wěn)定性好，易保存，單人份獨立包裝，試劑損耗少等優(yōu)點，適合臨床患者、健康體檢者等標本的快速篩查。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術缺陷，從提高檢測靈敏度出發(fā)，提供一種檢測靈敏度高、特異性強、檢測快速的間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒。本專利技術的第一方面公開了一種間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于所述襯底上，所述致敏乳膠聚酯膜上包被有彩色乳膠顆粒標記的抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅰ，免疫硝酸纖維素膜上設有包被了抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅱ的檢測線和包被了羊抗兔IgG的質控線。較優(yōu)的，所述彩色乳膠顆粒為粒徑290～300nm的聚苯乙烯顆粒。較優(yōu)的，所述彩色乳膠顆粒的顏色為紅色。本專利技術致敏乳膠聚酯膜上標記有彩色乳膠顆粒的抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅰ和免疫硝酸纖維素膜檢測線(T線)包被的抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅱ均為單克隆抗體。本專利技術的另一方面，提供了一種間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：1)致敏乳膠顆粒的制備：用羧基化的聚苯乙烯標記抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ι，獲得致敏乳膠顆粒；2)致敏乳膠聚酯膜的制備：用步驟1)獲得的致敏乳膠顆粒包被聚酯膜，獲得致敏乳膠聚酯膜；3)將抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅱ和羊抗兔抗體分別噴在硝酸纖維素膜檢測線(T線)和質控線(C線)的位置上，烘干備用，制得免疫硝酸纖維素膜；4)將濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在PVC片上，切裁制得試劑條；5)將試劑條裝入塑料盒，獲得間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒。較優(yōu)的，所述步驟1)致敏乳膠顆粒的制備為：a.取一定體積的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍體積20mMpH6.0的碳酸緩沖溶液多次沖洗、離心、棄上清，獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀；b.用1～1.5倍體積20mMpH6.0的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀，并加入1～1.5倍體積的水溶性炭化二亞胺，室溫下攪拌20～30分鐘，最后用2～3倍體積0.01MpH8.0的硼酸緩沖溶液多次沖洗、離心、棄上清，獲得待標記物；c.向步驟b獲得的所述待標記物中加入2～3倍體積0.2MpH7.0的硼酸緩沖液制成乳膠懸液，并向所述乳膠懸液中加入抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ι；d.充分反應過夜，加入終止劑終止反應，獲得致敏乳膠顆粒。在致敏乳膠顆粒的制備過程中，加入的水溶性炭化二亞胺、各緩沖溶液的體積均以初始所取的羧基化的聚苯乙烯的體積為基準，按本專利技術所述的體積倍數加入：如所取的羧基化的聚苯乙烯顆粒的體積為1ml，則需要加入的pH6.020mM的磷酸緩沖溶液體積可以為1～1.5ml，pH7.00.2M的硼酸緩沖液的體積為2～3ml。更優(yōu)的，所述步驟a中碳酸緩沖溶液為20mMpH6.0含0.01％SDS的碳酸緩沖溶液。添加有SDS的碳酸緩沖溶液可以更好的洗去乳膠的表面活性物，清洗效果更好。更優(yōu)的，所述步驟a中羧基化的聚苯乙烯濃度為6～12w/v％。更優(yōu)的，所述步驟a中的離心條件為12000～14000rpm，離心10min。更優(yōu)的，所述步驟b中水溶性炭化二亞胺的濃度為9～10mg/ml。更優(yōu)的，所述步驟b中的離心條件為12000～14000rpm，離心10min。更優(yōu)的，所述步驟c乳膠懸液中羧基化的聚苯乙烯顆粒偶聯(lián)抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ι的量為：0.5mg抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ι/10mg聚苯乙烯顆粒。更優(yōu)的，所述步驟d中終止劑為50mMpH8.2的Tris-HCl。本專利技術中，v％指體積百分比；w/v％指重量體積百分比，如1w/v％即為100ml溶液中含1g物質。較優(yōu)的，所述步驟2)中致敏乳膠聚酯膜的制備具體步驟為：A.用乳膠緩沖液稀釋致敏乳膠顆粒，獲得0.3～0.5w/v％的致敏乳膠溶液；B.用步驟A制備好的致敏乳膠溶液噴涂聚酯膜，干燥，制得致敏乳膠聚酯膜。更優(yōu)的，所述步驟A中的乳膠緩沖液配方如下：9～11v％1.0MTris液，0.25～0.35w/v％聚乙二醇20000，0.18～0.20w/v％牛血清白蛋白，0.15～0.25w/v％脫脂牛奶，0.28～0.30w/v％酪蛋白，和0.04～0.06w/v％疊氮化鈉，用鹽酸調節(jié)pH至8.0±0.02，余量為水。最優(yōu)的，所述步驟A中的乳膠緩沖液配方如下：10v％1.0MTris液、0.3w/v％聚乙二醇20000、0.2w/v％牛血清白蛋白，0.2w/v％脫脂牛奶、0.3w/v％酪蛋白，和0.05w/v％疊氮化鈉，用鹽酸調節(jié)pH至8.0±0.02，余量為水。進一步較優(yōu)的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和特異性，本專利技術所述的乳膠緩沖液還包括下列組分：果糖、氯化鉀和甘氨酸，且果糖、氯化鉀和甘氨酸的總濃度為3.25～4.75g/L，緩沖液的pH值為7.3－7.5。更優(yōu)選的，各組分在乳膠緩沖液中的濃度為：果糖1.0-2.0g/L；氯化鉀0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。更優(yōu)的，步驟B中用致敏乳膠溶液噴涂聚酯膜，每261mm×220mm聚酯膜上噴涂1.28ml致敏乳膠溶液，干燥，制得致敏乳膠聚酯膜。較優(yōu)的，所述步驟3)中，噴在硝酸纖維素膜質控線(C線)上的羊抗兔IgG的濃度為1.0～2.0mg/ml，噴在硝酸纖維素膜檢測線(T線)上的抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅱ濃度為1.0～2.0mg/ml。較優(yōu)的，每50m長硝酸纖維素膜分別包被有6ml的羊抗兔IgG和6ml的抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅱ溶液，檢測線和質控線的間距為4.0～6.0本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于所述襯底上，其特征在于，所述致敏乳膠聚酯膜上包被有彩色乳膠顆粒標記的抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅰ，免疫硝酸纖維素膜上設有包被了抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅱ的檢測線和包被了羊抗兔IgG的質控線。

【技術特征摘要】
1.一種間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于所述襯底上，其特征在于，所述致敏乳膠聚酯膜上包被有彩色乳膠顆粒標記的抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅰ，免疫硝酸纖維素膜上設有包被了抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅱ的檢測線和包被了羊抗兔IgG的質控線。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述彩色乳膠顆粒為粒徑290～300nm的聚苯乙烯顆粒。3.權利要求1-2任一權利要求所述的間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：1)致敏乳膠顆粒的制備：用羧基化的聚苯乙烯標記抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ι，獲得致敏乳膠顆粒；2)致敏乳膠聚酯膜的制備：用步驟1)獲得的致敏乳膠顆粒包被聚酯膜，獲得致敏乳膠聚酯膜；3)將抗間日瘧原蟲醛縮酶單克隆抗體Ⅱ和羊抗兔抗體分別噴在硝酸纖維素膜檢測線和質控線的位置上，烘干備用，制得免疫硝酸纖維素膜；4)將濾樣紙、致敏乳膠聚酯膜、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在PVC片上，切裁制得試劑條；5)將試劑條裝入塑料盒，獲得間日瘧原蟲乳膠法檢測試劑盒。4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)致敏乳膠顆粒的制備為：a.取一定體積的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍體積20mMpH6.0的碳酸緩沖溶液多次沖洗、離心、棄上清，獲得羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀；b.用1～1.5倍體積20mMpH6.0的磷酸緩沖溶液懸浮上一步獲得的羧基化的聚苯乙烯顆粒沉淀，并加入1～1.5倍體積的水溶性炭化二亞胺，室溫下攪拌20～30分鐘，最后用2～3倍體...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：白春夢，毛遠麗，丁曉輝，
申請(專利權)人：上海凱創(chuàng)生物技術有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31